1、堿性磷酸酶染色(NAP) 堿性磷酸酶染色（堿性磷酸酶染色（NAPNAP） 目的目的 掌握卡氏偶氮偶聯法測定中性粒細胞堿性磷酸酶染色的原理、掌握卡氏偶氮偶聯法測定中性粒細胞堿性磷酸酶染色的原理、 方法、注意事項和臨床意義。方法、注意事項和臨床意義。 原理原理 中性粒細胞胞質中的堿性磷酸酶在中性粒細胞胞質中的堿性磷酸酶在pH9.6pH9.6的堿性條件下能水解的堿性條件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者與重氮鹽偶聯形成不溶性的有色磷酸萘酚，生成萘酚，后者與重氮鹽偶聯形成不溶性的有色沉淀定位于胞質中的酶活性處。重氮鹽有多種，常用的有堅沉淀定位于胞質中的酶活性處。重氮鹽有多種，常用的有堅牢藍牢藍RRRR、

2、堅牢藍、堅牢藍BBBB、堅牢紫醬等。、堅牢紫醬等。 堿性磷酸酶染色(NAP)新鮮干燥的涂片用冷新鮮干燥的涂片用冷10%10%甲醛甲醇固定液固定甲醛甲醇固定液固定30s30s，流水輕輕沖洗，流水輕輕沖洗303060s60s，待干。，待干。把涂片浸入基質孵育液中，在室溫把涂片浸入基質孵育液中，在室溫( (冬季放水浴箱冬季放水浴箱) )下溫育下溫育101015min15min。流水沖洗流水沖洗1 1 2min2min，加蘇木素染色液中復染，加蘇木素染色液中復染5 58min8min，流水沖洗，待，流水沖洗，待干，鏡檢。干，鏡檢。結果判斷胞質中出現紫黑色或棕紅色顆粒為陽性。判斷標準如下：結果判斷胞質中

3、出現紫黑色或棕紅色顆粒為陽性。判斷標準如下： 0 0分：胞質中無陽性染色顆粒。分：胞質中無陽性染色顆粒。 1 1分：胞質中含少量顆粒或呈彌漫淺色。分：胞質中含少量顆粒或呈彌漫淺色。 2 2分：胞質中含中等量的顆粒或呈彌漫著色。分：胞質中含中等量的顆粒或呈彌漫著色。 3 3分：胞質中含較多顆粒或彌漫較深色。分：胞質中含較多顆粒或彌漫較深色。 4 4分：胞質中充滿粗大顆粒或彌漫深色。分：胞質中充滿粗大顆粒或彌漫深色。5 5 計算陽性率和積分值。計算陽性率和積分值。 方法步驟方法步驟堿性磷酸酶染色(NAP)磷酸萘酚鹽和重氮試劑品種繁多，應根據基質選擇相適磷酸萘酚鹽和重氮試劑品種繁多，應根據基質選擇相

4、適應的重氮鹽，堅牢藍等重氮鹽的質量好壞是本法成敗的應的重氮鹽，堅牢藍等重氮鹽的質量好壞是本法成敗的關鍵。關鍵。基質孵育液必須臨用前新鮮配制，先應將血膜固定干燥基質孵育液必須臨用前新鮮配制，先應將血膜固定干燥后，才開始配制基質液。后，才開始配制基質液。1. 若無若無2-氨基氨基-2-甲基甲基-1,3-丙二醇，可用巴比妥緩沖液丙二醇，可用巴比妥緩沖液(pH9.2)或或0.2mol/L Tris緩沖液緩沖液(pH9.2)代替。代替。 注意事項注意事項堿性磷酸酶染色(NAP) 臨床上主要用于鑒別：臨床上主要用于鑒別：1. 慢性粒細胞白血病與類白血病反應：慢性粒細胞白血病與類白血病反應： 慢性粒細胞白血

5、病慢性粒細胞白血病(無繼發性感染者無繼發性感染者)時，時，NAP積分一般明顯下降，積分一般明顯下降，積分常積分常13分，甚至為零分；類白血病反應時則顯著增高，積分，甚至為零分；類白血病反應時則顯著增高，積分常分常200分。分。2. 陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥與再生障礙性貧血：陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥與再生障礙性貧血： 陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥常降低；再生障礙性貧血常增高，病陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥常降低；再生障礙性貧血常增高，病情好轉時，情好轉時，NAP積分則可逐漸下降。積分則可逐漸下降。3. 急性白血病的細胞類型：急性白血病的細胞類型：ALL增高，增高，AML下降。下降。臨床意義臨床意義堿性磷

6、酸酶染色(NAP) 鐵染色（鐵染色（Iron stain）目的目的 掌握骨髓鐵染色的原理、方法、注意事項及臨床意義。掌握骨髓鐵染色的原理、方法、注意事項及臨床意義。原理原理 骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細胞外鐵，其所含的三價鐵骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細胞外鐵，其所含的三價鐵經稀鹽酸處理后而游離，并能與酸性亞鐵氰化鉀溶液發經稀鹽酸處理后而游離，并能與酸性亞鐵氰化鉀溶液發生普魯士藍反應，生成藍色亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含生普魯士藍反應，生成藍色亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位。細胞內鐵也可用此法顯示，根據反應的強弱鐵的部位。細胞內鐵也可用此法顯示，根據反應的強弱可了解骨髓中鐵的含量。可了解骨髓中鐵的含量

7、。堿性磷酸酶染色(NAP)干燥涂片用甲醇固定干燥涂片用甲醇固定10min10min，待干。，待干。玻片上滴滿酸性亞鐵氰化鉀，玻片上滴滿酸性亞鐵氰化鉀，3737染色染色30min30min。用蒸餾水沖洗后用核固紅染液復染用蒸餾水沖洗后用核固紅染液復染101015min15min。流水沖洗，待干，鏡檢。流水沖洗，待干，鏡檢。結果判斷結果判斷 (1) (1) 幼紅細胞核呈鮮紅色，胞質呈淡黃紅色，鐵粒呈藍綠色。幼紅細胞核呈鮮紅色，胞質呈淡黃紅色，鐵粒呈藍綠色。(2) (2) 細胞外鐵細胞外鐵 用低倍鏡觀察涂片，特別是涂片尾部和髓粒附近，注用低倍鏡觀察涂片，特別是涂片尾部和髓粒附近，注 意翠藍色顆粒的存

8、在，可分五級標準。意翠藍色顆粒的存在，可分五級標準。(3) (3) 細胞內鐵細胞內鐵 用油鏡計數用油鏡計數100100個中、晚幼紅細胞，記錄胞質中含有藍個中、晚幼紅細胞，記錄胞質中含有藍色鐵顆粒的細胞色鐵顆粒的細胞( (鐵粒幼細胞鐵粒幼細胞) )的百分率。根據細胞內鐵顆粒的數目、的百分率。根據細胞內鐵顆粒的數目、大小、染色深淺和顆粒分布的情況，將鐵粒幼細胞分為四型。大小、染色深淺和顆粒分布的情況，將鐵粒幼細胞分為四型。方法步驟方法步驟堿性磷酸酶染色(NAP)細胞外鐵的劃分標準細胞外鐵的劃分標準: :(-)(-)：無顆粒。：無顆粒。(+)(+)：有少數鐵顆粒或偶見鐵小珠：有少數鐵顆粒或偶見鐵小珠

9、( (顆粒體積大于嗜酸性粒細胞的顆粒者顆粒體積大于嗜酸性粒細胞的顆粒者 稱為鐵小珠稱為鐵小珠) )。(+)(+)：有較多的鐵顆粒或小珠。：有較多的鐵顆粒或小珠。(+)(+)：有很多的鐵顆粒、小珠和少數小塊狀。：有很多的鐵顆粒、小珠和少數小塊狀。(+)(+)：有極多鐵顆粒、小珠，并有很多的小塊，密集成堆。：有極多鐵顆粒、小珠，并有很多的小塊，密集成堆。鐵粒幼細胞劃分：鐵粒幼細胞劃分：型：幼紅細胞內含型：幼紅細胞內含1 12 2個小鐵顆粒。個小鐵顆粒。型：幼紅細胞內含型：幼紅細胞內含3 35 5個小鐵顆粒。個小鐵顆粒。型：幼紅細胞內含型：幼紅細胞內含6 61010個小鐵顆粒，或個小鐵顆粒，或1-4

10、1-4個大鐵顆粒。個大鐵顆粒。型：幼紅細胞內含型：幼紅細胞內含1010個以上小鐵顆粒，或個以上小鐵顆粒，或5 5個以上大鐵顆粒。個以上大鐵顆粒。 環形鐵粒幼細胞：環形鐵粒幼細胞：是指幼紅細胞含鐵粒是指幼紅細胞含鐵粒6 6個，繞核個，繞核2/32/3以上者。以上者。堿性磷酸酶染色(NAP)玻片需經去鐵處理玻片需經去鐵處理 將新玻片用清潔液浸泡將新玻片用清潔液浸泡24h24h，取出，取出后反復水洗浸入后反復水洗浸入95%95%酒精中酒精中24h24h，晾干，再浸泡在，晾干，再浸泡在5%5%鹽酸鹽酸中中24h24h，用雙蒸水反復浸洗玻片，取出烤干后備用。，用雙蒸水反復浸洗玻片，取出烤干后備用。骨髓取

11、材要滿意，外鐵一定要有骨髓碎塊或顆粒，取材骨髓取材要滿意，外鐵一定要有骨髓碎塊或顆粒，取材不佳時，往往影響結果。不佳時，往往影響結果。1.1. 酸性亞鐵氰化鉀溶液須新鮮配制。酸性亞鐵氰化鉀溶液須新鮮配制。注意事項注意事項堿性磷酸酶染色(NAP)鑒別缺鐵性貧血和非缺鐵性貧血：鑒別缺鐵性貧血和非缺鐵性貧血：IDA時骨髓細胞外鐵顯著減少或消失，時骨髓細胞外鐵顯著減少或消失，鐵粒幼紅細胞明顯減少，所見鐵粒細小色淺，且以鐵粒幼紅細胞明顯減少，所見鐵粒細小色淺，且以型為主，型為主，型極少見，型極少見，型以上不見。經鐵劑治療后細胞外鐵及內鐵可迅速增多，此檢查是診斷型以上不見。經鐵劑治療后細胞外鐵及內鐵可迅速增多，此檢查是診斷IDA及指導鐵劑治療的一種輔助方法；非及指導鐵劑治療的一種輔助方法；非IDA，如，如HA、MA、AA等病人的等病人的細胞外鐵通常增高，內鐵亦增高，以細胞外鐵通常增高，內鐵亦增高，以型、型、型為主，可以見到型為主，可以見到型，罕型，罕見見型。因此，有