1、Vol. 6No. 1Mar. 2006Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology中 國(guó) 食 品 學(xué) 報(bào)第 6卷第 1期2006年 3月綠豆中蘋果酸脫氫酶的性質(zhì)及生物進(jìn)化的研究汪少蕓葉秀云饒平凡(福州大學(xué)生物工程研究所福州 350002摘要首次報(bào)道了豆科植物來(lái)源的蘋果酸脫氫酶 綠豆蘋果酸脫氫酶的純化及表征 。 前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已于2005年發(fā)表于 Journal of Food Biochemistry , 本文對(duì)該綠豆中蘋果酸脫氫酶的性質(zhì)及生物進(jìn)化等做了進(jìn)一步研究 。 結(jié)果顯示 :蘋果酸脫氫酶對(duì)底物草酰乙酸的米氏常數(shù)為

2、112mol/L 。 酶活性受金屬離子效應(yīng)物影響 , 其中KCl 對(duì)酶有激活作用 , CaCl 2和 MgCl 2對(duì)酶活影響不大 , ZnCl 2、 PbCl 2和 CuSO 4表現(xiàn)出不同程度的抑制酶活作用 。鋅離子對(duì)該酶的作用屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制 。 通過(guò) Edman 降解法測(cè)定其 N-氨基酸序列為 N-ASEPGPERKVAVL-GAAGGIG-20, 與其它植物來(lái)源的蘋果酸脫氫酶的同源性分別達(dá)到 75%95%。 采用 CLUSTAL W 多序列比對(duì)軟件產(chǎn)生的進(jìn)化樹結(jié)構(gòu) , 與綠豆親緣關(guān)系由近至遠(yuǎn)依次是大豆 、 蘋果樹 、 西瓜 、 土豆 、 芥菜 、 苜蓿 、 番茄 。 關(guān)鍵詞 綠豆蘋果酸脫

3、氫酶金屬離子抑制進(jìn)化文章編號(hào)1009-7848(2006 01-0262-05蘋果酸脫氫酶 (malate dehydrogenase , MDH 是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞三羧酸循環(huán) (TCA 的關(guān)鍵 酶之一 。 它在檸檬酸循環(huán)中催化蘋果酸形成草酰 乙酸 , 也可催化草酰乙酸形成蘋果酸 。 而草酰乙酸 是生物體內(nèi)生化反應(yīng)的一個(gè)重要的中間產(chǎn)物 , 連 接多條重要的代謝途徑 , 是氨基酸形成所必需的 碳骨架的主要來(lái)源之一 1。 除此以外 , 蘋果酸脫氫 酶還在細(xì)胞的多 種 生 理 活 動(dòng) 中 扮 演 著 重 要 的 角 色 , 涉及線粒體的能量代謝 、 蘋果酸 -天冬氨酸穿 梭系統(tǒng) 、 植物的抗病性

4、(其酶活力的異常變動(dòng)可作 為植物對(duì)疾病易感性和抗病性早期鑒別的手段 以及植物抗病過(guò)程中的活性氧代謝等 。 在 C4植物 光合作用中蘋果酸脫氫酶也擔(dān)負(fù)著重要的功能 。 一些 C4旱生植物如玉米 、 甘蔗等 , 為保證有足夠 濃度的 CO 2參與 C3光合碳還原循環(huán) , 進(jìn)入葉組織 的 CO 2首先在葉肉細(xì)胞中與烯醇式磷酸丙酮酸反 應(yīng)生成草酰乙酸 , 草酰乙酸經(jīng)蘋果酸脫氫酶作用 生成蘋果酸后被輸送到維管束鞘細(xì)胞 , 并進(jìn)一步 由蘋果酸酶作用釋放出 CO 2進(jìn)入 C3循環(huán) 。 所以MDH 系統(tǒng)不僅是研究酶區(qū)域化和酶調(diào)節(jié)的好系統(tǒng) , 也為研究各細(xì)胞器之間的聯(lián)系和許多發(fā)育問(wèn)題提供了方便 12。蘋果酸脫氫

5、酶作為生物代謝的關(guān)鍵酶之一 , 其研究意義十分重大 。 目前已從水稻 、 玉米中篩選 出蘋果酸脫氫酶基因 , 并對(duì)其進(jìn)行克隆 、 表達(dá)以及 生物活性的研究 , 其中有相當(dāng)一部分是關(guān)于西方 蜜蜂蘋果酸脫氫酶基因與配合力及雜種優(yōu)勢(shì)的研 究 , 也有關(guān)于動(dòng)植物的發(fā)育期間蘋果酸脫氫酶同工酶的分析 34, 但對(duì)于豆科植物中蘋果酸脫氫酶的研究 , 目前還未見(jiàn)報(bào)道 。本研究的前期工作是通過(guò)食品生化的方法得 到純化的綠豆蘋果酸脫氫酶 , 并對(duì)其酶的比活力 、 回收率 、 等電點(diǎn) 、 作用溫度 、 pH 和熱穩(wěn)定性等性質(zhì) 進(jìn) 行 了 表 征 , 結(jié) 果 發(fā) 表 于 Journal of Food Bio-che

6、mistry 5。 本文旨在此基礎(chǔ)上對(duì)目前國(guó)內(nèi)外首例報(bào)道的豆科植物蘋果酸脫氫酶做進(jìn)一步的研究 , 包括金屬離子對(duì)酶活的影響 、 金屬離子對(duì)酶活的 抑制類型 、 通過(guò) Edman 降解法測(cè)定其 N-氨基酸 序列并比較其與其它植物來(lái)源的蘋果酸脫氫酶的 同源性及生物進(jìn)化關(guān)系 。1材料與方法1.1材料與儀器苯異硫氰酸 、 三甲胺及 PTH-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品等收稿日期 :2005-08-29資助項(xiàng)目 :福建省教育廳資助項(xiàng)目 (No.JB05040 作者簡(jiǎn)介 :汪少蕓 , 女 , 1970年出生 , 副教授 通訊作者 :饒平凡第 6卷 第 1期綠豆中蘋果酸脫氫酶的性質(zhì)及生物進(jìn)化的研究 圖 1蘋果酸脫氫酶對(duì)草酰

7、乙酸的米氏常數(shù)Fig.1Determination of K m value of malate dehydrogenase for oxaloacetate試劑 , 美國(guó) PE 公司 ; 輔酶 NADH 及底物草酰乙酸 (OAA , Sigma 公司 。 實(shí)驗(yàn)所用的其它所有試劑均 為國(guó)產(chǎn)分析純 。蛋白質(zhì)固相序列分析儀 (Applied Biosystems476A , 美國(guó) PE 公司 ; Bio -10型可見(jiàn)紫外分光 光度計(jì) , 美國(guó) PE 公司 。 1.2樣品的制備利 用 硫 酸 銨 沉 降 、 弱 陽(yáng) 離 子 色 譜 CM-Sephadex C-50、 POROS 20HS 高效液相強(qiáng)

8、陽(yáng)離子交換色譜等方法從綠豆中分離純化出生物活性物 質(zhì)蘋果酸脫氫酶 MDH 7, 并經(jīng) SDS-聚丙烯酰胺凝 膠電泳 、 反向毛細(xì)管色譜鑒定純度后 , 收集樣品備 用 。1.3米氏常數(shù) K m 的測(cè)定試驗(yàn)中固定 NADH 為 150mol/L 不變 , 草酰乙 酸 的 濃 度 分 別 配 制 為 50、 100、 150、 200、 300、400和 600mol/L 。 取純化的蘋果酸脫氫酶樣品 1mg , 按照 Sayre 6方法測(cè)定各自的酶活力 。 繪制 Lineweaver-Burk 圖 , 計(jì)算出蘋果酸脫氫酶在 30 下對(duì)底物草酰乙酸 (OAA 的 K m 值 。 1.4金屬離子對(duì)酶活

9、的影響分別配制濃度為 1.0mmol/L 和 2.0mmol/L 的 KCl 、 CaCl 2、 MgCl 2、 ZnCl 2、 PbCl 2和 CuSO 4溶 液 , 加 入到含 0.2mmol/L 草酰乙酸和 0.15mmol/L NADH的磷酸緩沖液中 , 以未加任何金屬離子的體系作 為空白對(duì)照 , 在 pH 7.4、 30 為標(biāo)準(zhǔn)條件下 , 檢測(cè) 金屬離子對(duì)酶活的影響 。1.5金屬離子對(duì)酶活的抑制類型以 ZnCl 2為例 , 配制濃度為 1.0mmol/L 和 3.0mmol/L 的 ZnCl 2溶液 , 同米氏常數(shù)測(cè)定方法測(cè)定 各自的酶活力 , 繪制 Lineweaver-Burk

10、圖 , 計(jì)算金屬離子對(duì)酶活的抑制類型 。1.6N-末端氨基酸序列測(cè)定高 度 純 化 的 樣 品 經(jīng) SDS-PAGE 鑒 定 為 電 泳純的蛋白溶液 , 將其吸附在玻璃纖維素膜上 , 并放 入測(cè)序儀的反應(yīng)腔中進(jìn)行測(cè)序 。 根據(jù) Edman 降解 法測(cè)定蛋白質(zhì) N-末端氨基酸序列原理 , 對(duì)蘋果酸 脫氫酶的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析 , 最終得到 N-末端序 列 。1.7氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化關(guān)系分析CLUSTAL W. 生物信息學(xué)軟件 7是使用最廣泛的多序列比對(duì)程序 , 它采用漸進(jìn)的方法 , 先將多 個(gè)序列兩兩比對(duì)構(gòu)建距離矩陣 , 反應(yīng)序列之間的 兩兩關(guān)系 , 然后根據(jù)距離矩陣計(jì)算產(chǎn)生系統(tǒng)進(jìn)化 指導(dǎo)樹 ,

11、 對(duì)關(guān)系密切的序列進(jìn)行加權(quán) , 再?gòu)淖罹o密 的兩條序列開(kāi)始 , 逐步引進(jìn)鄰近的序列 , 不斷重新 構(gòu)建比對(duì) , 直到所有序列都被加入為止 , 從而使序 列比較的結(jié)果更可靠 。2結(jié)果與分析2.1米氏常數(shù) K m 的測(cè)定在 30 、 pH 7.4條件下測(cè)量不同底物濃度下的反應(yīng)速度 (酶催化反應(yīng)的初速度通常可以用酶 活表示 , 1個(gè)酶活單位以 unit 表示 , 并描繪 1/V 對(duì) 1/OAA 的雙倒數(shù)曲線圖 (如圖 1所示 。 擬合的 線性方程為 :y =11.154x +99.651。 根據(jù)米氏常數(shù) 的原理 , 令圖 1中縱坐標(biāo) y =0, 則橫坐標(biāo) x 的截距 為 -99.651/11.154

12、=-8.934, 而 -1/K m =-8.934, 所 以可得底物草酰乙酸 OAA 的米氏常數(shù) K m =112mol/L 。有資料表明 , 細(xì)菌 MPOB 的蘋果酸脫氫酶對(duì) 草酰乙酸 OAA 的米氏常數(shù) K m 為 50mol/L8, 綿羊肝臟的蘋果酸脫氫酶對(duì)草酰乙酸 OAA 的米氏 常數(shù) K m 為 400mol/L 9。而綠豆 MDH 對(duì)草酰乙酸 OAA 的米氏常數(shù) K m 為 112mol/L , 介于它們之間 , 說(shuō)明酶催化反應(yīng)時(shí)酶和底物草酰乙酸的親和 力居中 。2.2金屬離子對(duì)酶活的影響受試金屬離子對(duì)酶活力的影響見(jiàn)表 1。 不同的金屬離子對(duì) 蘋 果 酸 脫 氫 酶 活 性 的 影

13、 響 是 不 同263中 國(guó) 食 品 學(xué) 報(bào)2006年第 1期 的 , 如 KCl 對(duì)酶有激活作用 ; CaCl 2和 MgCl 2對(duì)酶 活影響不大 ; ZnCl 2、 PbCl 2和 CuSO 4表現(xiàn)出不同程 度的抑制酶活作用 , 其中 CuSO 4的抑制能力最強(qiáng) , 當(dāng)其濃度為 1mmol/L 時(shí) , 酶活被抑制率達(dá) 97%。2.3金屬離子對(duì)酶活的抑制類型以 ZnCl 2為例 , 測(cè)定其抑制類型 , 結(jié)果見(jiàn)圖 2。 由圖 2可以看出 , 在鋅離子存在的情況下 , 1/V 增 大 , 即反應(yīng)速度和最大反應(yīng)速度減小 , 但 K m 不變 , 所以可以判斷鋅離子對(duì)該酶的作用屬于非競(jìng)爭(zhēng)性 抑制 。

14、2.4N-末端氨基酸序列測(cè)定將純化的樣品放入測(cè)序儀的反應(yīng)腔中進(jìn)行測(cè)序 , 根據(jù) Edman 降解法測(cè)定蛋白質(zhì) N-末端氨基 酸序列原理 , 對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析 , 最終得到的N-末 端 序 列 為 N-ASEPGPERKVAVLGAAGGIG-20, 即 :N-丙氨酸 、絲氨酸 、 谷氨酸 、 脯氨酸 、 甘氨 酸 、 脯氨酸 、 谷氨酸 、 精氨酸 、 賴氨酸 、 纈氨酸 、 丙氨 酸 、 纈氨酸 、 亮氨酸 、 甘氨酸 、 丙氨酸 、 丙氨酸 、 甘氨 酸 、 甘氨酸 、 異亮氨酸 、 甘氨酸 -20。2.5氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化關(guān)系分析索到包括大豆 、 苜蓿和芥菜等 8種不同植物來(lái)源的MD

15、Hs 的 N-末端氨基酸序列 , 如表 2所示 。 應(yīng)用CLUSTAL W 多序列比對(duì)軟件 1將它們與綠豆 MDH 進(jìn)行了 N-末瑞氨基酸序列比較 , 結(jié)果見(jiàn)表 2。表 1金屬離子對(duì)蘋果酸脫氫酶活力的影響Table 1The effect of metal ions on malate dehydrogenase activity化學(xué)試劑 濃度 /mmol L -1相對(duì)酶活力 /%空白對(duì)照13.1020.00表 2不同植物來(lái)源的 MDH 的 N-末端氨基酸序列位點(diǎn)與同源性比較Table 2N-terminal amino acids sequence and their homology co

16、mparison among different plant MDHsMDH 來(lái)源殘基N-末端氨基酸序列 殘基同源性 /%綠豆 (Phaseolus mungo 1ASEPGPERKVAVLGAAGGIG 20100大豆 (Glycine max 27ASEPVPERKVAVLGAAGGIG 4695苜蓿 (Medicago sativa 24ATEPVPERKVAILGAAGGIG 4385土豆 (Solanum tuberosum 23ASESAPDRKVAILGAAGGIG 4280西瓜 (Citrullus lanatus 28ATESVPERKVAVLGAAGGIG 4785蘋果樹

17、(Eucalyptus gunnii 29_SESVPERKVAVLGAAGGIG 4789番茄 (Lycopersicon esculentum 27ASGSAPERKVAVLGAAGGIG 4685芥菜 (Arabidopsis thaliana 23ASESVPDRKVVILGAAGGIG 4275相同或保守的位點(diǎn) (*, :表示 :. *:*. :*圖 2鋅離子對(duì)酶活的抑制類型Fig.2The inhibition type of zinc to enzyme activity264第 6卷 第 1期綠豆中蘋果酸脫氫酶的性質(zhì)及生物進(jìn)化的研究 圖 3不同植物來(lái)源的 MDHs 進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)F

18、ig.3The phylogenetic tree of different plant MDHs參 考 文 獻(xiàn)1. Goward C.R. , Nicholls D.J. Malate dehydrogenase :A model for structure , evolution and catalysis J. Prot. Sci. , 1994, 3:188218882. Gietl C. Malate dehydrogenase isoenzymes :cellular locations and role in the flow of metabolites between the

19、 cytoplasm and cell organelles J. Biochim. Biophys. Acta , 1992, 1100:2172343. Ocheretina O. , Scheibe R. Cloning and sequence analysis of cDNAs encoding plant cytosolic malate dehydrogenaseJ. Gene. , 1997, 199:1451484. Harrison J. F. , Nielsen D. I. , Page R. E. Malate dehydrogenase phenotype tempe

20、rature and colony eVects on flight metabolic rate in the honey-bee Apis mellifera J. Funct. Ecol. , 1996, 10:81885. Wang Shaoyun , Ye Xiuyun , Rao Pingfan et al. Purification and characterization of a malate dehydrogenase from Phaseolus mungo (mung bean J. Journal of food biochemistry , 2005, 29(2 :

21、1171306. Sayre RT , Kennedy RA , Dringnitz DJ. Photosynthetic enzyme activities and locatization in mollugo verticillata popula-tion differing in the levels of C3and C4cycleoperation J. Plant Physiol. , 1979, 64:2932997. Higgins D. G , Thompson J. D , Gibson T. J. Using CLUSTAL for multiple sequence

22、 alignments J. Methods Enzy-mol. , 1996, 266:3834028. Van Kuijk , B. L. M. and Stams , A. J. M. Purification and characterization of the malate dehydrogenase from the syn-trophic propionate-oxidizing bacterium strain MPOB J. FEMS Microbio. Lett. , 1996, 144:1411449. Vessal M. and Tabei S. M. B. Part

23、ial purification and kinetic properties of cytoplasmic malate dehydrogenase from Ovine Liver Echinococcus granulosus protoscolices J. Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. , 1996, 113:757763由表 2可以看出 , 綠豆 MDH 與其它植物來(lái)源 的 MDHs 的同源性在 75%95%不等 , 與豆科來(lái)源 的大豆同源性最高 , 達(dá)到 95%。 由此可見(jiàn) , 本實(shí)驗(yàn) 用的綠豆 MDH 與其它同功能

24、的 MDHs 具有較高 的相似性 , 而且被比較的 MDHs 之間相同或保守 的位點(diǎn)很多 , 在 20個(gè)位點(diǎn)中就有 15個(gè)之多 。不同植物來(lái)源的 MDHs 的 N-末端氨基酸序 列采用 CLUSTAL W. 多序列比對(duì)軟件產(chǎn)生的進(jìn)化 樹結(jié)構(gòu) (Phylogenetic Tree 如圖 3所示 。 進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)是對(duì)不同物種的同源蛋白質(zhì)的氨基酸組成順序 或相應(yīng)的核酸的核苷酸組成順序的差異進(jìn)行比較 研究 , 進(jìn)而確定它們的親緣關(guān)系 、 分歧年代和進(jìn)化 速度 。 由圖 3可知 , 被比較的這些 MDHs 親緣關(guān)系 比較密切 , 從分化距離的遠(yuǎn)近來(lái)看 , 與綠豆親緣關(guān) 系最密切的是大豆 , 其次由近至遠(yuǎn)依

25、次是蘋果樹 、 西瓜 、 土豆 、 芥菜 、 苜蓿 、 番茄 。3結(jié)論綠豆蘋果酸脫氫酶對(duì)草酰乙酸的米氏常數(shù) K m為 112mol/L , 介于文獻(xiàn)所報(bào)道的 50400mol/L 之間 , 說(shuō)明酶催化反應(yīng)時(shí)酶和底物草酰乙酸的親和 力居中 。 蘋果酸脫氫酶活性受金屬離子效應(yīng)物的影 響 , 即 KCl 對(duì)酶有激活作用 , CaCl 2和 MgCl 2對(duì)酶活 影響不大 , ZnCl 2、 PbCl 2和 CuSO 4表現(xiàn)出不同程度 的抑制酶活作用 。 因此在調(diào)節(jié)蘋果酸脫氫酶活性時(shí) , 應(yīng)根據(jù)不同的金屬離子對(duì)蘋果酸脫氫酶活性的 影響而控制酶活的大小 。265中 國(guó) 食 品 學(xué) 報(bào)2006年第 1期!韓

26、國(guó)推出可降血糖面包據(jù)悉 , 韓國(guó)浦項(xiàng)機(jī)構(gòu)農(nóng)協(xié)利用栽培的 7種農(nóng)產(chǎn)品 , 生產(chǎn)出一種具有降血糖功能的 “ 蘑菇南瓜面包 ” 。 “ 蘑菇南瓜面包 ”的原料為再生蘑菇 、 韓國(guó)大米 、 冬蟲夏草 、 南瓜粉 、 南瓜汁 、 桑蘑提取液 、 干草提取 液 。 再生蘑菇是蘑菇栽培農(nóng)民李才旭在去年年初成功培育出的新品種蘑菇 , 經(jīng)實(shí)驗(yàn) , 對(duì)調(diào)節(jié)血糖有明顯 效果 。 據(jù)浦項(xiàng)一大學(xué)臨床營(yíng)養(yǎng)系的吳承熙教授及韓國(guó)蘑菇協(xié)會(huì)臨床實(shí)驗(yàn)表明 , 再生蘑菇的降血糖功能僅 次于胰島素 。蘑菇南瓜面包曾在去年農(nóng)協(xié)中央會(huì)和中小企業(yè)振興廳承辦的 “ 農(nóng)產(chǎn)品品評(píng)會(huì) ” 及 “ 農(nóng)產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)大戰(zhàn) ” 中分獲鼓勵(lì)獎(jiǎng) 。(消息來(lái)源 :

27、中國(guó)食品報(bào) The Research on Further Property and Phylogenetic Relationshipof Malate Dehydrogenase from Mung BeanWang ShaoyunYe XiuyunRao Pingfan(Institute of Biotechnology , Fuzhou University , Fuzhou 350002Abstract The study was reported for the first time that a novel malate dehydrogenase was purified from leguminousplants. The research was focused on further property and phylogenetic relationship of malate dehydrogenase (MDH from mung bean (Phaseolus mungo , in succession with the early results publi