1、熒光光譜法在蛋白質研究中的應用尹燕霞,向本瓊,佟麗(北京師范大學生命科學學院,北京100875摘要:熒光光譜法對研究蛋白質結構及其構象變化是很重要的。描述了熒光光譜的概念、發光機理及特點,介紹了熒光光譜儀的儀器原理和結構,記述了熒光光譜技術在檢測蛋白質的構象變化、蛋白質的含量和酶活性方面的具有應用。關鍵詞:熒光光譜法;蛋白質;構象中圖分類號:O 657.3;T Q937文獻標志碼:A 文章編號:1002-4956(201002-0033-04The application of studying fluorescence spectroscopy on proteinYin Yanxia ,X

2、iang Benqio ng ,Tong Li(College o f Life Science ,Beijing N or mal U nive rsity ,Beijing 100875,China A bstract :F luore scence spectro sco py is ve ry impor tant for studying pro tein structure and co nfo rmatio n changes .T he co ncept and principle of f luore scence spectroscopy a re intro duced

3、at first ,then the applicatio n o f studying fluor escence spectro scopy o n pr otein is ex plained .Key words :f luore scence spec troscopy ;pro tein ;co nf orma tion 收稿日期:2009-05-25基金項目:“生物化學大實驗校級精品課”建設項目及“生命科學創新人才實驗教學體系建設與改革”教改項目(127016作者簡介:尹燕霞(1978,女,山東省泰安市人,碩士,實驗師,主要從事:生物化學與分子生物學實驗教學.1熒光光譜技術某些物

4、質被一定波長的光照射時,會在較短時間內發射出波長比入射光長的光,這種光稱為熒光。熒光光譜在各方面的應用及有關的方法稱為熒光光譜技術。1.1熒光發光機制每一個分子具有一系列分離的電子能級,每一電子能級中又有一系列的振動能級和轉動能級。當物質被光照射后,大約在10-15s 內光被物質吸收,物質分子獲得能量,分子內的電子躍遷到較高能級而變成激發態。處于激發態的分子很不穩定,它首先通過內轉換將部分能量轉移給周圍分子,回到最低電子激發態振動能級(稱為第一級電子激發態振動能級,處于這一能級的分子平均壽命大約是10-8s ,如果這時分子通過發射相應的光量子來釋放剩余能量而回到基態的各個不同的振動能級,就產生

5、了熒光。因此,最低第一級電子激發態振動能級是產生熒光的基礎。由于分子發射熒光前已有一部分能量被消耗,所以熒光能量要比物質吸收的光能量小,因而熒光的發射波長總比激發波長長。圖1熒光產生機理1.2常用熒光參數熒光光譜包括激發光譜和發射光譜兩種。激發光ISS N 1002-4956CN11-2034/T 實驗技術與管理E xperim ental Technology and M anagem ent 第27卷第2期2010年2月Vol .27No .2Feb .2010譜是熒光物質在不同波長的激發光作用下測得的某一波長處的熒光強度的變化情況;發射譜則是在某一固定波長的激發光作用下熒光強度在不同波長

6、處的分布情況。在發射譜中最大熒光強度對應的熒光波長稱為最大熒光波長,記為max,它是熒光光譜的一個重要參數,對環境的極性和熒光團的運動很敏感。為了有利于測定,一般都選擇激發光譜的峰位測定發射光譜,選擇發射光譜的峰位測定激發光譜1。激發光譜與發射光譜呈鏡象對稱關系。熒光強度是最常用的參數,與很多因素有關,可用下列公式表示:F=K0(1-c-b c式中:F是熒光強度;K是儀器常數;是量子產率;0是激發強度;是摩爾吸收系數;b是熒光池的光徑;c 是熒光物質溶液的濃度。當溶液很稀時,上式可簡化為F=K0bc=K0A式中A為光吸收值,A=bc。可知,在低濃度下,樣品濃度和熒光強度呈線性關系。利用此公式,

7、可用熒光光譜法測定熒光物質,如氨基酸、蛋白質含量。量子產率表示熒光物質發射熒光的本領,用表示。其定義為發射的光量子數與吸收的光量子數之比,又稱熒光效率或量子效率。若兩種溶液測量條件完全相同,則可用相對法測定:1/2=F1A2/F2A1,F是熒光強度,A為光吸收值。量子產率的改變必然會引起熒光強度的改變。因此,如果要研究量子產率的相對值,只要測量熒光強度也就足夠。2熒光光譜儀原理及結構能發射熒光的物質稱為熒光物質。測定熒光光譜的儀器稱熒光光譜儀,其結構上的最主要特點是入射的激發光與熒光探測方向垂直。其工作原理是由高壓汞燈或氙燈發出的紫外光和藍紫光經濾光片照射到樣品池中,激發樣品中的熒光物質發出熒

8、光,熒光經過濾和反射后,被光電倍增管接受,然后以圖或數字的形式顯示出來。圖2是本實驗室的Fluo ro Max-2熒光光譜儀示意圖。儀器主要由光源、激發單色器、發射單色器、樣品池、檢測器以及顯示系統組成。熒光光譜儀常用光源有鎢燈、氫燈、氘燈、汞燈、激光燈等,紫外光源用得最多。氙燈在200800nm范圍內具較好的發射光譜。汞燈是校準用光源。單色器用來選擇特定波長的單色光入射到樣品上。檢測器一般用光電管或光電倍增管,將光信號放大并轉為電信號。熒光光譜儀的樣品池是四面透光的石英杯,且用去熒光石英材料制成,它可以作為紫外分光光度計的樣品池。測量液體時,光源與檢測器成直角安排。紫外分光光度計的樣品池是兩

9、面透光的樣池,它不能作為熒光光譜儀的樣品池。發射光單色器或稱第二單色器放在樣品池和檢測器之間,其作用是讓被測樣品所發生的熒光透過,而濾去由激發光所發生的反射光、閃射光,也就是用來選擇一定波長的光進入檢測器測量。計算機輔助記錄系統用以完成繪圖及熒光強度的測量 。圖2熒光光譜儀示意圖3蛋白質的內源熒光與熒光探針利用熒光光譜法研究蛋白質,一般有兩種方法。一是測定蛋白質分子的自身熒光(內源熒光,另一種是當蛋白質本身不能發射熒光時,通過非共價吸附或共價作用向蛋白質分子的特殊部位引入外源熒光(也稱熒光探針,然后測定外源熒光物質的熒光。3.1蛋白質的內源熒光含有芳香族氨基酸(色氨酸(trptophan,Tr

10、p、酪氨酸(ty rosine,Ty r和苯丙氨酸(pheny lalanine, Phe殘基的蛋白質在280nm或295nm的激發光的激發下會產生熒光,這種熒光稱為內源性熒光(天然熒光。蛋白質熒光來自于Trp、Ty r以及Phe,其熒光光譜對環境極為敏感,成為研究蛋白質的結構、折疊動力學以及蛋白質分子間相互作用的一種理想選擇。T rp、Tyr和Phe由于其側鏈生色基團的不同而有不同的熒光光譜。其熒光峰位波長分別是348、303、282nm,其中T rp的熒光強度最大,而Phe的熒光強度則很低,因此蛋白質的內源熒光主要是由Trp和Tyr殘基形成的。同時在含有Trp和Tyr的蛋白質中,由于其分子

11、發生了從Ty r殘基到Trp殘基的能量轉移,從而導致Ty r殘基的熒光猝滅和Trp殘基的熒光增加,因而Trp最常被用作內源探針來研究蛋白質的結構。34實驗技術與管理3.2蛋白質的外源熒光現在常用外源熒光光譜法來測定蛋白質的疏水微區、二基團之間的距離以及酶與底物結合過程中的蛋白質構象變化等。所謂外源熒光光譜法就是利用小分子熒光化合物與其熒光較弱或不發熒光的物質共價或非共價結合,形成發強熒光的絡合物,然后,測定絡合物的熒光。常用測定蛋白質的熒光探針主要有丹磺酰氯、熒光胺、1-苯胺基萘-8-磺酸(1-anilinonaphthalene-8-sulfo nate,ANS、2-對甲苯胺基萘-6-磺酸(

12、2-p-to luidinonathalene-6-sulfonate,TNS、1-(N-二甲基胺-萘-5-磺酸(1-(N-dimethy lamino-naphthalene-5-sulfo nate,DNS等。4熒光光譜法在蛋白質研究中的應用4.1利用蛋白質的天然熒光檢測蛋白質的構象變化利用蛋白質中的芳香族氨基酸殘基的側鏈基團具有吸收紫外區域的入射光從而發射熒光的特性,來研究蛋白質在變性或復性過程中整體空間構象的變化。其基本機理是:熒光來源于生色團基團在不同電子能級之間的躍遷,熒光頻率取決于能級之間的能量差,生色團基團與周圍基團的相互作用可能會改變其處于激發態時所具有的能量,從而改變其發射

13、熒光的頻率與強度。同一種熒光分子在不同極性的環境中,其最大吸收波長可能會有所差別。一般來說,極性環境會影響生色團基團的基態和激發態能級,減少激發態的能量,從而引起發射譜的紅移(使max增大。在天然的蛋白質中,可產生熒光的芳香族氨基酸分子多處于蛋白質的內部,被多種非極性氨基酸殘基包圍,因此其所處的局部小環境的極性弱于蛋白質分子外部水溶液的極性。蛋白質變性過程中,芳香族氨基酸分子的側鏈基團逐漸暴露于水溶液中,其所處的環境極性逐漸增加,因此蛋白質熒光發射峰的max逐漸增大。max紅移的程度可以反映蛋白質構象變化的程度,紅移程度越大,則表明蛋白質在變性過程中構象變化的程度越大。反過來,蛋白質復性過程中

14、,芳香族氨基酸分子的側鏈逐漸內埋于蛋白質內部,其所處的環境極性逐漸降低,因此蛋白質熒光發射峰的max逐漸減小,稱為max的藍移。通過測定蛋白質max藍移的程度,可以推算其整體構象變化的程度。圖3是本科生物化學實驗教學中學生用熒光光譜來研究大腸桿菌堿性磷酸酶在8 mol/L尿中不同變性時間下的光譜圖,可以看出,最大發射波長向長波方向移動,從333nm紅移到354 nm(紅移,說明酶的構象在發生改變,酶正在發生變性,且隨著變性時間的增加,紅移程度越大,表明構象變化的程度越大。圖4是尿變性后的堿性磷酸酶在不同復性時間下的光譜圖,整體趨勢與變性時相反,最大波長向短波方向移動,說明蛋白質的構象在發生一定

15、的變化,松散的結構逐步折疊組裝成高級結構,蛋白在發生復性,且隨著復性時間的增加,藍移程度越大,表明堿性磷酸酶的構象逐漸恢復到天然構象狀態 。圖3 堿性磷酸酶變性過程中內源熒光光譜的測定圖4堿性磷酸酶復性過程中內源熒光光譜的測定4.2利用熒光探針檢測蛋白質的構象變化由于熒光探針的熒光光譜對環境變化十分敏感,因此它對蛋白質分子的構象變化也就十分敏感。例如用ANS做熒光探針的時候,它通過非共價結合到蛋白質分子的非極性區域中時,其熒光光譜會隨著所處環境非極性的增加而發生藍移,且熒光強度也隨之提高,最大吸收/發射在375/500nm,在一定范圍內,熒光強度與蛋白質的濃度呈線性關系。利用ANS的這個性質,

16、可以衡量ANS結合的蛋白質部位的極性的變化,根據極性的變化又可以進一步推測蛋白質結構的變化。用A NS標記鈣調蛋白磷酸酶B亞基(calci-neuring B subunit,CNB,在有鈣離子存在時的熒光光譜與沒有鈣離子時相比有明顯變化,表明鈣離子的存在會引起CNB構象的變化2。4.3測定蛋白質的含量利用蛋白質的內源熒光,可以檢測蛋白質的含量,35尹燕霞,等:熒光光譜法在蛋白質研究中的應用其基本原理與紫外-可見分光光度法相仿,但靈敏度高于紫外吸收法。主要有標準曲線和內標法兩種。標準曲線法是在同樣條件下,以已知量的標準熒光蛋白質配成不同濃度的標準溶液,將在熒光光譜儀上測得的值繪成標準曲線,然后

17、再測未知樣品值,利用標準曲線求出熒光物質的含量。內標法通常是在一定的濃度范圍內,選擇合適的標準蛋白溶液濃度,將其在熒光光譜儀上測得的值與在同樣條件下測得的未知樣品的值比較,計算求出未知樣品的濃度。蛋白質中伯胺還可以與熒光胺反應生成發熒光的化合物,其熒光強度與蛋白質的含量成正比,因而可利用熒光胺測定蛋白質的含量,但也必須預先測定已知濃度的標準蛋白溶液的熒光強度3。4.4測定酶的活性熒光光譜法是測定酶活性的一種方法,主要是根據底物或產物的熒光性質的差別來進行測定,其靈敏度要比紫外及可見分光光度法高若干個數量級,而且熒光強度與激發光的光源有關,因此在酶活性的測定中越來越多地被采用,特別是用于一些快速

18、反應的測活性場合。熒光光譜法的一個缺點是易受其他物質干擾。例如酶本身的內源熒光的干擾。故用熒光法測定酶活力時,盡可能選擇酶的內源熒光較弱的可見光范圍進行測定。如乳酸脫氫酶(lac-tate dehydrogenase,LDH的活性測定,乳酸脫氫酶可催化乳酸與氧化態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nico-tinamide adenine dinucleo tide,NAD+的反應,NAD+被還原為原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adinine dinucleotide,NADH,NADH能被強堿轉換成熒光化合物,則可以測定其熒光強度,用于度量乳酸脫氫酶的活性。4.5研究小分子與蛋白質

19、間的相互作用熒光光譜法是研究生物大分子與小分子、離子相互作用的重要手段。在相互作用研究中常采用熒光猝滅法,熒光猝滅是指由于熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用引起熒光強度降低的現象。熒光猝滅法分為動態猝滅和靜態猝滅兩種方式,其具體理論參見陳國珍的有關論著4。熒光猝滅法多用于研究生物大分子,如蛋白質與小分子藥物或金屬離子的相互作用,可引入外源性熒光作為探針,也可利用蛋白質自身的內源性熒光。借助熒光猝滅法可測得藥物分子與蛋白質的結合常數及結合點數,再依據Forster能量轉移機制可求出供體與受體間的結合距離及能量轉移效率5。該法應用十分廣泛6-8,且常與紫外可見吸收光譜法及圓二色譜法一起

20、使用,相互驗證。5蛋白質熒光光譜研究的一些新方法5.1同步熒光光譜同步熒光技術是在同時掃描激發和發射波長的情況下來測繪熒光光譜圖。由測得的熒光強度信號對激發或發射波長作圖,即為同步熒光光譜。它包括固定波長的和固定能量的同步熒光兩種光譜。固定波長的同步熒光光譜是在同步掃描中,激發波長em和發射波長ex保持固定的波長間距(=em-ex,即在為常數的情況下掃描,以同步熒光信號對發射或激發波長測繪熒光光譜圖9。固定能量的同步熒光光譜是指在同步掃描過程中,是激發波長與發射波長之間保持著固定的能量差,即使得波數差=(1/ex-1/em×107(cm-1為常數10。在構成蛋白質的20種氨基酸中,僅

21、有芬香族氨基酸Trp、Ty r、Phe是發熒光的基團,但由于三者在普通熒光光譜中的激發光譜和發射光譜相互重疊,不能同時測定,給研究蛋白質的工作帶來困難。采用固定波長的同步掃描時,由< 15nm所得到的同步光譜顯示Ty r的光譜,而> 60nm的同步光譜,則呈現Trp的光譜特征11,選用=55nm進行同步掃描,則可同時測定Ty r、Trp、Phe殘基的發射光譜12。5.2三維熒光光譜法三維熒光光譜是由激發波長(Y軸、發射波長(軸和熒光強度(軸三維坐標所表征的矩陣光譜,也叫總發光光譜。該技術可獲得激發波長與發射波長同時變化的熒光強度信號,它能較直觀地表明Trp殘基在蛋白質分子中的微環境

22、及其在不同條件下的構象變化13。5.3熒光共振能量傳遞分析熒光共振能量轉換(fluorescence resonance energy transfer,FRET是指兩個熒光受色基團足夠近時,供體分子吸收一定頻率的光子后,被激發到更高的電子態,在回到基態前,通過偶極子相互作用實現能量向鄰近的受體分子轉移。FRET由兩部分組成:鑭系元素螯和物為能量供體,有機探針為受體。FRET是進行結合分析(抗體-抗原;受體-配體,肽-蛋白或蛋白-蛋白激酶分析的理想工具。此中分析基于兩種標記:能量供給長時間衰減螯和物標記;短時間衰減有機接受體。當標記物被帶到非常接近結合反應時能量轉移發生。根據記錄接收體的時間分

23、辨熒光量來檢測轉移的能量。6結束語熒光光譜法是研究蛋白質結構和構象的一種有效方法,常與圓二色光譜、吸收光譜、核磁共振、電子自旋(下轉第40頁 圖5虛擬電子秤組成應變片傳感器使用前面實驗中用到的裝置。調理電路采用直流電橋,電橋的形式由學生自己選擇,采用儀表放大電路進行電壓信號調理。數據采集模塊可由提供的3種不同總線板卡和4種串口通信形式中任選。最后,在使用LabVIEW 軟件完成虛擬電子秤的功能設計和前面板規劃。4.2電機轉速檢測與控制電機轉速檢測與控制是一個典型的單入單出自動控制系統8,通過這個實驗項目的學習,學生可以接觸到計算機控制系統的各個環節和內容。圖6為電機轉速檢測與控制的組成框圖 。

24、圖6電機轉速檢測與控制組成該實驗項目的控制對象選用原有的直流電機,傳感器采用GK405,頻壓轉換電路可采用前面提到的電路。學生需要使用LabVIEW 軟件測量轉速并完成PID 控制器的編寫。5結束語提高實驗部分沒有規劃實驗課時,學生可以在課外時間進實驗室進行相關內容的學習。檢測技術實驗室自主類實驗項目的設計與建設已經全部完成,經過一個學期的運行,新實驗項目激發了學生實驗的積極性和主動性,學生反映良好,基本達到了預期目標。本實驗項目的開發是在現有模式和條件下積極改善實驗教學效果的一種嘗試。參考文獻(References :1孫建民,楊清梅.傳感器技術M .北京:清華大學出版社,2007.2曹才開

25、.檢測技術與應用M .長沙:中南大學出版社,2009.3孔德仁.工程測試技術M .北京:科學出版社,2009.出版社,2005.5賽爾吉歐·佛朗哥.基于運算放大器和模擬集成電路的電路設計M .3版.西安:西安交通大學出版社,2004.6侯國屏,王坤,葉齊鑫.Lab VIEW 7.1編程與虛擬儀器設計M .北京:清華大學出版社,2005.7楊樂平,李海濤,楊磊.Lab VIEW 程序設計與應用M .2版.北京:電子工業出版社,2005.8高金源.計算機控制系統M .北京:高等教育出版社,2003.(上接第36頁共振波譜等技術互相補充,給出更全面的數據和結果,成為蛋白質及生命科學研究中的

26、有利工具。參考文獻(References :1陶慰孫,姜涌明.蛋白質分子基礎M .北京:高等教育出版社,1995.2Jiang Guohua ,W ei Qun ,Fu nction and structure of N -termianl an dC -termiandl d om ain s of calcineurin B sub unit J .Biol Chem ,2003,384(9:1299-303.3王煒,廖國寧,季金林,等.熒光微量檢測細胞內DNA 與蛋白質含量J .1999,28(3:267-272.4陳國珍.熒光分析法M .北京:科技出版社,1990.5Lakow icz J R .Principles of fluorescence spectroscopy M .NewYo rk :Plenum Press ,1983.6王峰,黃薇,唐波,等.蒂巴因與牛血清白蛋