1、編號:JN-20110912illumi na SNP分析技術方案書晶能生物技術（上海）有限公司二0年九月十二日晶能生物技術（上海）有限公司公司背景lllumi na公司是一家從事開發，制造及銷售用于分析遺傳變異和生物功能的綜合系統的高科技公司，于1998年成立，2005年進入中國，2007和2009年 兩次入選福布斯雜志評出的全美年度成長速度最快的高科技公司，同時亞太地區是 lllumi na全球增長最快的區域。公司在福布斯所公布的2009年度成長最快的高科技公司中超越Google ，位列榜首。lllumi na的業務范圍包括生物芯片技術，和新一代高通量測序技術兩大領域，具體則包括測序分析、

2、基因表達分析、基因調控及表觀遺傳學分析、蛋白篩選分 析、基因分型及CNV （拷貝數變異）分析。當然最為用戶所知的是30倍磁珠覆蓋產生的業內最高重復度及準確率，另外基因分型分析作為一種新興遺傳學技術，也正成為Illumina的一種核心技術。這項技術能夠從核酸水平分析導致個體疾病的遺傳變異，為多基因復雜疾病易感性，復雜疾病的發生機制和疾病防治與藥物開發等領 域的研究提供幫助。在Illumina領先技術引導下，以大規模SNP基因分型數據為基礎的全基因組關聯分析技術 將為未來的個體化疾病診斷奠定基礎。Illumina并購新一代高通量測序技術公司 Solexa后，測序成為川umina另一項核心技術，華大

3、基因（BGI ）近日花巨資購買的128臺最新的測序系統 -Hiseq 2000 系統是lllumina公司新發布的最高通量測序系統。利用兩個流動槽和一種新穎的雙表面成像方法，HiSeq 2000能夠在單次運行中產生600 Gb的數據，每天能產生75 Gb。該平臺已經將人類基因組的測序費用降至1萬美元以下。要知道早在幾年前人類基因組計劃全球數個國家花費了數億美元才完成這項工 作。晶能（Genergy ）生物技術有限公司是illumina自中國區總部移到上海后，聯合各方資源成立的專業服務平臺公司，公司成立以來完成了數百項服務項目，在華東地區競爭激烈的科研外包服務市場取得不錯比例的市場份額，也贏得了

4、客戶的認可，公司服務實驗室裝備華東地區第一臺Hiseq 2000測序儀，已經完美運作完成數十項二代深度測序項目。芯片平臺如iscan 平臺至今已完成3項GWAS項目，總計5000 個樣本；各類基因芯片總計3500 張。Sequenom質譜檢測系統完成近20萬個SNP位點分型。熒光定量服務近百項。晶能旨在能為 廣大科研開發工作者提供專業可靠的分子生物學科研外包服務。SNP檢測技術背景人類基因組計劃的完成，標志著人們進入了新的時代-后基因組學時代，人們從基因 的序列研究跨越到功能的研究。人類基因組計劃完成后，科學家發現任意兩個不相關的人的 DNA序列有99.9%是一致的，只有0.1%的差異。而這部

5、分0.1%由于包含了遺傳上的差異因素 而非常重要。這些差異造成人們罹患疾病的不同風險和對藥物的不同反應。單核苷酸多態性（sin gle-nu cleotide polymorphisms, SNP）成為研究及標記人與人之間微小差異的最佳遺傳標記。SNP是在基因組中，不同個體的DNA序列上的單個堿基的差異。如，某些人的染色體上某個位置的堿基是 A,而另一些人的染色體的相同位置上的堿基則是G除性染色體外，每個人體內的染色體都有兩份。一個人所擁有的一對等位位點的類型被稱作 基因型（genotype ）。檢定一個人的基因型，被稱作 基因分型（genotyping ）。人類的基因不 到三萬個，存在超過1

6、千萬個SNP其中3百萬個SNP決定了人類的異質性。SNP的篩選及檢 測來發現于疾病相關的 SNP位點，是了解引起人類疾病的復雜原因的最重要途徑之一。同時 這些SNP位點也標記著不同個體罹患各種疾病的風險，以及對藥物的不同反應。SNP是繼RFLP和STR后的第三代分子遺傳標記，以其為標簽，可尋找和發現疾病（如腫 瘤，高血壓，心臟病，各種精神性疾病等等）相關的基因。常用的方法是將一定數量的病人 檢體與正常人檢體作相關基因的SNP分析，觀察特定SNP在兩組人群中出現頻率的差別。隨著基因分型技術的飛速發展，越來越多與疾病有關的基因以及藥物效應的個體差異與基因多 型性的關系被闡明，SNP成為未來醫學中個

7、體化的疾病防治提供基礎，即朝向針對不同患者 的基因型態施以個人化醫療的方向發展。用于SNP分型的技術有高分辨率熔解（High-resolutionmelting ，簡稱HRM分析技術，基于一代San ger測序技術的分型 方法，基于質譜技術的 Seque nom MassARRAY分子量陣列 技術，及基于川umina GoldenGate?專利的定制芯片分型技術。目前前兩者技術因為分型成 本過高逐漸為后面三種技術所取代，而當單一樣本需要同時分型的位點數超過100個時，Illumi na Golde nGate?技術的成本是最低的且國際上公認度最高。人類全基因組計劃完成后，全球多個國家合作（美國

8、，英國，日本，中國等）啟動了一項后續計劃，人類單體型計劃（HapMap計劃），這個計劃的目的就是研究SNP位點和疾病的關 系，旨在建立一個人類健康、疾病以及對藥物和環境因子的個體反應差異相關的基因公用數 據庫。這一全球性計劃有70%勺數據就是在GoldenGate?這個專利技術平臺上產生的，其中中 國科學家承擔了共 10%勺工作，這中間 95泣作都是在 Golde nGate?技術平臺上完成的（見 Nature2005年10月封面文章）。nattire下附幾種SNF分型技術比較表SNF分型技術比較表技術名稱原理簡述單次反應通量平臺儀器單樣本單位點 分析成本HRM SNF分析技術通過不同基因型不

9、同 PCR反應時候退火溫 度不同，從溶解曲線 的差異識別基因型每個樣本1個位 點一次反應-zbb、/日熒光疋量PCF儀器50萬20-30 元一代Sanger測序技術通過對SNP&點前后 一段序列測序知道基 因型每個樣本1個位 點一次反應測序儀150萬20元Seque nom MassARRAY?NP分析技術由于SNP位點不同堿 基的分子量差別，質 譜方法識別通過磁場 到達接收裝置時間不 同來識別基因型每個樣本最多30個位點一次 反應Seque nom質譜儀300萬8-10 元Illumina GoldenGateSNP分析技術針對特定SNP位點設 計2-3組探針，其中 只有一組探針可以完 成擴

10、增，帶入的堿基 因為事先標記的特定 波長熒光信號而被識 別每個樣本最多1536個位點一次反應Illumi na 微珠芯片工作站150萬5元當樣本量及同時分 析樣本數多時更低要求同時分析樣本數480以上晶能生物技術（上海）有限公司附1:Goldengate的基本原理如下Gefionak: DM*1準備 gDNA 250ng2將gDNA和固相磁性小珠相連Hq* WvjhMgItMel-rrpH Ifta: eAirra-ian 99%。3. 實驗重復性高： 基于微珠芯片以及 GoldenGate ? 檢測獨特的設計：每個 SNP位點有30倍的重復，雜交在地址序列間發生等特點，檢測重復性99.7%。

11、4. 密度高，信息量大：面積直徑為15.75mm x 1.8mm的微珠芯片包含有900,000個微珠，其密度高 達400萬/cm2是目前密度最高的芯片， 是傳統芯片密度的4-400倍，而其研究通量為傳統基因分型 手段的8至48倍。5. 低樣品量：250ngDNA可檢測1536個SNP位點的基因型信息。6. 實驗過程全程監控內參微珠：芯片中設計了幾百個內參微珠對實驗過程進行監控，如：樣品污染，延伸特異性等。GenomeStudio基因分型分析軟件自動報告實驗監控結果。7. 完全均一：微珠芯片采用了微珠和光纖的設計，芯片點（微珠）大小完全均一：3微米，點和點之間間距完全均一：5.7微米。解決了傳統

12、芯片點大小，定位難以高度均一的瓶頸問題。8. 芯片生產100%QC質控：微珠芯片生產過程中專利的解碼技術，質控能深入到每張芯片上每個 微珠每個特性，保證數據的可靠性和重復性。9. 高性價比：單個位點的分析成本是其他技術的1/4甚至1/10.附2： illumina SNP分析技術部分文獻:Sigurdsson S, Nordmark G, Garnier S, Grundberg E, Kwan T, et al. (2008) A risk haplotype of STAT4 forsystemic lupus erythematosus is over-expressed, correl

13、ates with anti-dsDNA and shows additive effectswith two risk alleles of IRF5.Hum Mol Genet 17:2868-76.Karlsson EK, Lindblad-Toh K (2008) Leader of the pack: gene mapping in dogs and other model organisms. Nat Rev Genet 9:713-25.Identificationof ALK as a majorMoss?YP , Laudenslager M, Longo L, Cole K

14、A, Wood A, et al. (2008) familial neuroblastoma predisposition gene.Nature 455:930-5.晶能生物技術（上海）有限公司Cooper GM, Johnson JA, Langaee TY, Feng H, Stanaway IB, et al. (2008) A genome-wide scan for common genetic variants with a large influence on warfarin maintenance dose.Blood 112:1022-7.Levran O, Londo

15、no D, OHara K, Nielsen DA, Peles E, et al. (2008) Genetic susceptibility to heroin addiction; a candidate-gene association study.Genes Brain Behav Epub ahead of print.,Sakamoto H, Yoshimura K, Saeki N, Katai H, et al. (2008)Genetic variation in PSCA is associated withsusceptibility to diffuse-type g

16、astric cancer. Nat Genet 40:730-40.Chambers JC, Elliott P , Zabaneh D, Zhang W , Li Y , et al. (2008) Common genetic variation near MC4R is associated with waist circumference and insulin resistance.Nat Genet 40:716-8.Loos RJ, Lindgren CM, Li S, Wheeler E, Zhao JH, et al. (2008)Common variants near

17、MC4R are associatedwith fat mass, weight and risk of obesity.Nat Genet 40:768-75.Plenge RM, Seielstad M, Padyukov L, Lee AT, Remmers EF , et al. (2007) TRAF1-C5 as a risk locus forrheumatoid arthritis-a genomewide study.N Engl J Med 357:1199-209.Thorleifsson G, Magnusson KP , Sulem P , Walters GB, G

18、udbjartsson DF, et al. (2007) Common sequencevariants in the LOXL1 gene confer susceptibility to exfoliation glaucoma.Science 317:1397-400.Fellay J, Shianna KV , Ge D, Colombo S, Ledergerber B, et al. (2007)A whole-genome association studyof major determinants for host control of HIV-1.Science 317:9

19、44-7.A genetic risk factor for periodicStefansson H, Rye DB, Hicks A, Petursson H, Ingason A, et al. (2007)limb movements in sleep.N Engl J Med 357:639-47.Hakonarson H, Grant SF,Bradfield JP , Marchand L, Kim CE, et al. (2007)A genome-wide associationidentifies IL23R as an inflammatory bowel disease

20、 gene.Science 314:1461-3.Nature 448:591-4.study identifies KIAA0350 as a type 1 diabetes gene.Moffatt MF , Kabesch M, Liang L, Dixon AL, Strachan D, et al. (2007)Genetic variants regulating ORMDL3expression contribute to the risk of childhood asthma.Nature 448:470-3.Gudbjartsson DF , Arnar DO, Helgadottir A, Gretarsdottir S, Holm H, et al. (2007)Variants conferring riskof atrial fibrillation on chromosome 4q25.Nature 448:353-7.van Es MA, Van Vught PW , Blauw HM, Franke L, Sari