1、論著(基礎研究西地那非同系物逆轉人乳腺癌MCF-7/AD細胞的耐藥性研究季恒,葛如意,王德全,梅文杰,黃海波,周俊立,鄭士杰,石永超,汪保國,陳思東摘要目的腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance ,MD是腫瘤化療失敗和患者死亡的一個主要原因,研發無毒的MD逆轉劑是治愈腫瘤的一項探索性研究。文中探討2種西地那非同系物對人乳腺癌MCF-7/AD細胞耐藥性的逆轉作用。方法采用MTT 法檢測西地那非、西地那非同系物、多柔比星以及西地那非同系物與多柔比星聯合作用對人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/AD和敏感株MCF-7的抑制率及IC 50值;運用流式細胞術觀察分別經西地那非同系物處理前后,人乳

2、腺癌MCF-7/AD細胞內hodamine 123濃度的改變情況,并分析該2種同系物對乳腺癌細胞P-gp 蛋白外排功能的影響。結果MTT 結果顯示10mol /L 的2種西地那非同系物對MCF-7/AD細胞耐藥性的逆轉倍數分別是636和558;20mol /L 的2種西地那非同系物對MCF-7/AD細胞耐藥性的逆轉倍數分別是1183和1347;流式細胞術結果顯示經10、20mol /L 的西地那非同系物處理后的MCF-7/AD細胞內hodamine 123濃度明顯增強。結論一定濃度的西地那非同系物可抑制乳腺癌MCF-7/AD細胞P-gp 蛋的外排功能,并顯著逆轉其對多柔比星的耐藥作用。關鍵詞X

3、DNF1-0425;XDNF8-0113;多藥耐藥;逆轉;乳腺癌細胞中圖分類號9799文獻標志碼A 文章編號1008-8199(201403-0245-05基金項目:廣州市國際區域科技合作項目(2011J5200017作者單位:510006廣州,廣東藥學院研究生院季恒(醫學碩士研究生;510310廣州,廣東藥學院公共衛生學院(葛如意、王德全、梅文杰、黃海波、周俊立、鄭士杰、石永超、汪保國、陳思東通訊作者:汪保國,E mail :gdwangbaoguo163com Sildenafil homologues reverse the drug resistance of human breast

4、 cancer cell line MCF-7/ADJI Heng 1,GE u-yi 2,WANG De-quan 2,MEI Wen-jie 2,HUANG Hai-bo 2,ZHOU Jun-li 2,ZHENG Shi-jie 2,SHI Yong-chao 2,WANG Bao-guo 2,CHEN Si-dong 2(1Guangdong Pharmaceutical University ,graduate school ,Guangzhou 510006,Guangdong ,China ;2GuangdongPharmaceutical University ,School

5、of Public Health ,Guangzhou 510310,Guangdong ,China Abstract Objective Multidrug resistance (MDof carcinoma is an important cause of chemotherapy failure and mortality in cancer patientsThe aim of this study was to explore the reversal effect of XDNF1-0425and XDNF8-0113on Doxorubicin (DOX resistance

6、 in human breast cancer cell line MCF-7/ADin vitroMethods Using MTT assay ,we determined the inhibitory effect ofsildenafil ,XDNF1-0425,XDNF8-0113,DOX and DOX +sildenafil homologues on the growth of human breast cancer cell lines MCF-7and MCF-7/AD,and figured out the inhibitive concentration 50(IC 5

7、0We used flow cytometry to detect the concentration of rhoda-mine123in the MCF-7/ADcells treated with XDNF1-0425or XDNF8-0113and analyzed its effect on P-gp-mediated drug effluxesults The sensitivity of MCF-7/ADto DOX was significantly increased by the two sildenafil homologues XDNF1-0425andXDNF1-01

8、13in a dose-dependent manner (P 005XDNF1-0425and XDNF1-0113reversed the drug resistance of MCF-7/ADby 636and 558times at 10mol /L and by 1183and 1347times at 20mol /L ,respectivelyFlow cytometry showed significantly increased concentrations of rhodamine123in the MCF-7/ADcells after treated with the

9、two sildenafil homologues at 10or 20mol /LConclusion Sildenafil homologues at a certain concentration can inhibit P-gp-mediated drug efflux of the human breast cancer cell lineMCF-7/ADand effectively reverse its resistance to DoxorubicinKey words XDNF1-0425;XDNF8-0113;Mutidrug resistance ;everse ;Br

10、east cancer引言多藥耐藥(multidrug resistance ,MD是指腫瘤細胞長期接觸某一化療物后可產生對此種化療藥物耐藥性,而且可對其他結構和作用機制不同的多種化療藥物產生交叉耐藥性。多柔比星(Doxorubicin 是乳腺癌化療的常用藥物,乳腺癌細胞的對多柔比星產生耐藥是多柔比星化療失敗的主要原因1,也是影響臨床腫瘤患者預后的重要因素2。乳腺癌是排名第一的女性常見惡性腫瘤,尋找克服乳腺癌MD的藥物或方法成為當前腫瘤研究的熱點3。目前研究發現MD的有效抑制劑有維拉帕米、環孢素A、三苯氧胺、類固醇激素46等,但這些耐藥逆轉劑干擾傳統的抗癌藥物藥代動力學,且由于可引起嚴重的毒副

11、作用等,至今都未取得預期的臨床效果,因此在臨床上被限制使用。尋找低毒高效且與合用的抗腫瘤藥物無藥動學交互作用的抑制劑,以提高藥物的利用度,避免和降低藥物的不良反應在指導臨床抗腫瘤個體化治療方面具有重要意義,同時也是當前腫瘤耐藥性研究中的重要發展方向。西地那非(Sildenafil,又譯昔多芬,是一種研發治療心血管疾病藥物時意外發現的治療男性勃起功能障礙藥物。已有研究發現5型磷酸二酯酶抑制劑西地那非7和伐地那非8能逆轉P-gp蛋白介導的MD。同時也有研究發現西地那非和伐地那非可逆轉MD相關蛋白7(MP7介導的紫杉醇耐藥9。本研究所用藥物是西地那非的同系物,由本實驗室指導廣東藥學院藥科學院實驗室合

12、成的新型化合物,擁有獨立的知識產權。本研究旨在通過觀察藥物處理后MCF-7/AD和MCF-7細胞株的生長抑制率、hodamine123濃度,探討西地那非同系物體外實驗的安全性極其逆轉乳腺癌MCF-7/AD細胞耐藥性的機制。1材料與方法11細胞株實驗所用MCF-7和MCF-7/AD細胞株由中山大學附屬腫瘤醫院惠贈;其中MCF-7/ AD細胞株是通過濃度遞增的多柔比星反復間歇誘導獲得,對多柔比星耐藥,而MCF-7細胞則為敏感細胞株。12藥物和器材本研究所用藥物是由廣東藥學院藥科學院實驗室合成的新型化合物,化學物結構式見圖1(自編號XDNF1-0425和XDNF8-0113,其電噴霧質譜(ESI-M

13、s分別為m/z4123(M+H+和m/z3313(M+H+;西地那非單體由圣約翰大學陳哲生教授惠贈;多柔比星、MTT、hodam-inel23均購于美國Sigma公司,DMEM培養基購于美國Hyclone公司,倒置顯微鏡為日本Nikon公司產品,流式細胞儀為美國BD公司產品。13細胞培養人乳腺癌細胞MCF-7和MCF-7/ AD于含10%胎牛血清和青霉素(100U/mL、鏈霉素(100U/mL的DMEM培養液中常規培養(37、5%CO2。實驗前在無藥培養基中培養2周。細胞隔日換1次培養液,每隔3、4天傳代1次 。a:XDNF1-0425;b:XDNF8-0113;c:西地那非圖1XDNF1-0

14、425、XDNF8-0113和西地那非結構圖Figure1Structural formulas of XDNF1-0425,XDNF8-0113and sildenafil14MTT法檢測細胞毒性實驗141MTT法10測定2種西地那非同系物體外實驗的安全濃度取對數生長期MCF-7和MCF-7/ AD細胞進行種板(8000細胞/孔,CO2的培養箱培養24h后分別加入不同濃度的XDNF1-0425和XDNF8-0113(1、10、100、1000mol/L,不加藥物的為陰性對照組,只加培養基的為調零組,每組設3個復孔;繼續培養68h后加入10L MTT(5mg/mL,培養4h后酶標儀(波長570

15、nm檢測吸光值(A,并繪制藥物濃度與細胞生存率曲線圖。細胞生存率=A加藥組/A對照組100%142MTT法測定2種西地那非同系物對MCF-7/ AD耐藥的逆轉作用采用上述方法將準備好的MCF-7和MCF-7/AD細胞分組種板,每組設3個復孔。24h后加藥,共分5組:只加培養基的調零組;不加藥物只加細胞的陰性對照組;多柔比星組:按濃度梯度分別加入多柔比星(001、003、01、03、10、30、100、300mol/L,每孔10L;多柔比星+藥物組:XDNF1-0425和XDNF8-0113分別以無毒劑量(25、50、100、200mol/L與多柔比星共同加入;多柔比星+西地那非組:不同濃度的西

16、地那非(25、50、100、200mol/L與多柔比星共同加入。CO2的培養箱繼續培養68h后常規MTT比色法測定和記錄各孔A值,并計算抑制率、半抑制率(IC50以及逆轉倍數。IC50通過線性回歸分析計算,細胞抑制率和逆轉倍數公式計算如下:細胞抑制率(%=(1實驗孔A值/對照孔A值100%逆轉倍數=耐藥細胞IC50/藥物干預下IC50 15細胞內hodamine123累積實驗取對數生長期MCF-7和MCF-7/AD細胞種于6孔板加入不同濃度XDNF1-0425和XDNF8-0113(100、200mol/L,CO2的培養箱孵育24h后收獲。用胰酶制成細胞懸液并分組裝致8個離心管:調零組(只加細

17、胞懸液;陰性對照組(細胞中只加入含有10 mg/mL的hl23;XDNF1-0425(10mol/L+hodamine123組;XDNF1-0425(20mol/L+hodamine123組;XDNF8-0113(10mol /L +hodamine123組;XDNF8-0113(20mol /L +hodamine123組;西地那非(10mol /L +hoda-mine123組;西地那非(20mol /L +hoda-mine123組;各組細胞在37條件下振蕩溫育60min ,離心后預冷PBS 洗滌細胞2遍,流式細胞儀測定細胞內平均熒光強度(mean fluorescence intens

18、ity ,Ex 488nm ,Em 530nm ,檢測藥物對細胞內hodamine 123含量的影響。16統計學分析采用SPSS 130軟件進行統計分析,定量數據以均數標準差(x s 表示,多組均數比較用單因素方差分析,兩兩組間多重比較用LSD 檢驗,僅對兩組均數的比較用Student 's t 檢驗,以P 005為差異有統計學意義。2結果212種西地那非同系物的安全濃度測定XDNF1-0425和XDNF8-0113對細胞株MCF-7和MCF-7/AD的細胞毒性作用,結果見圖2。XDNF1-0425和XDNF8-0113對細胞株的IC 50均100mol /L ,在20mol /L 濃

19、度時細胞存活率均90%,因此后續實驗選用25、5、10和20mol /L 4個濃度的XDNF1-0425和XDNF8-0113對人乳腺癌MCF-7/AD細胞耐藥性的逆轉作用。 圖2XDNF1-0425和XDNF8-0113對細胞株MCF-7和MCF-7/AD的生長抑制作用Figure 2Inhibitory effects of DNF1-0425and XDNF8-0113at different concentrations on MCF-7andMCF-7/ADcells22XDNF1-0425和XDNF8-0113對MCF-7/AD耐藥的逆轉作用MTT 結果顯示在單獨加入多柔比星的對照

20、組中MCF-7和MCF-7/AD2種細胞株的IC 50分別為(015008mol /L 和(1763173mol /L ,可見MCF-7/AD細胞對多柔比星耐藥(耐藥倍數為1175;XDNF1-0425各濃度組干預后多柔比星對MCF-7/AD細胞的IC 50分別下降至(1305056、(780157、(277077、(149069mol /L ,多柔比星對MCF-7/AD細胞的IC 50在多柔比星+XDNF1-0425各濃度組較多柔比星組明顯下降,有統計學意義(P 005或P 001,逆轉倍數為分別為135、226、636和1183倍,見表1。但多柔比星對MCF-7細胞的IC 50與XDNF1

21、-0425的加入與否其差異無統計學意義(P 005;XDNF8-0113各濃度組干預后所得的IC 50值與單用多柔比星組比較有明顯下降,差異有統計學意義(P 005或P 001,逆轉倍數為分別為104、209、558、1347倍,見表1。研究表明XDNF1-0425和XDNF8-0113能有效逆轉MCF-7/ADM 細胞對多柔比星的耐藥性,且在一定濃度范圍內XDNF1-0425和XDNF8-0113的濃度與逆轉效果成正比。作為對照組單用西地那非與多柔比星處理后逆轉倍數為分別為372、826、1544、2483倍。表1XDNF1-0425和XDNF8-0113逆轉MCF-7/AD細胞對多柔比星的

22、耐藥性(x s ,mol /L Table 1Effects of sildenafil homologues on the sensitivity of MCF-7and MCF-7/ADcells to Doxorubicin (x s ,mol /L 組別IC 50MCF-7/AD逆轉倍數多柔比星組1763173100多柔比星+西地那非組25mol /L 474104*37250mol /L 213097*826100mol /L 114077*1544200mol /L071069*2483多柔比星+XDNF1-0425組25mol /L1305056*13550mol /L 7801

23、57*226100mol /L 277077*636200mol /L149069*1183多柔比星+XDNF8-0113組25mol /L1648086*10450mol /L 824123*209100mol /L 309091*558200mol /L128044*1347與多柔比星組比較,*P 005、*P 00123細胞內hodamine123累積實驗hodamine123是一種特異性的P-gp 蛋白熒光底物,通過細胞內hodamine 123的蓄積來反映藥物抑制P-gp 蛋白活性的效率,表現為測得的細胞內熒光強度。經10和20mol /L XDNF1-0425和XDNF8-0113

24、處理后的MCF-7/AD細胞,hodamine l23熒光波峰右移,見圖3,且在一定濃度范圍內XDNF1-0425、XDNF8-0113和西地那非能夠抑制MCF-7/AD細胞內hodamine123的外排,見表2;提示XDNF1-0425和XDNF8-0113可抑制MCF-7/AD細胞P-gp 蛋白的外排功能,增加hodamine 123在細胞內的蓄積。 a:調零組;b:陰性對照組;c:100mol/L XDNF1-0425處理組;d:200mol/L XDNF1-0425處理組;e:100mol/L XDNF8-0113處理組;f:200mol/LXDNF8-0113處理組;g:100mol

25、/L西地那非處理組;h:200mol/L西地那非處理組圖3流式細胞術檢測細胞內hodamine123熒光強度Figure3hodamine123retention analyzed by FCM表2MCF-7/ADM細胞中不同濃度西地那非及其同系物對hodamine123外排的抑制作用(xsTable2Inhibitory effects sildenafil and its homologues on rhodamine123efflux in MCF-7/ADM cells(xs組別平均熒光強度(n=3外排抑制率(%陰性對照組214015XDNF1-0425組100mol/L2530091

26、835231*200mol/L2740172783143* XDNF8-0113組100mol/L2490241667057*200mol/L2770092948193*西地那非組100mol/L2570352021094*200mol/L2970153857286*外排抑制率=(經藥物處理的熒光強度陰性對照組的熒光強度/陰性對照組的熒光強度100%與陰性對照組比較,*P005,*P0013討論MD是目前影響腫瘤患者化療成功的一個主要因素,隨著對MD現象及其機制的不斷深入研究,發現MD的產生不是由單一因素引起的,而是多種機制共同參與作用的結果,包括腫瘤細胞凋亡逃避、DNA損傷后修復能力增強、抗

27、癌藥物作用分子靶點發生改變、抗癌藥物代謝酶活性增強11、藥物攝取降低以及進入內藥物被主動轉運到細胞外12等。近年來,關于天然提取物對腫瘤細胞MD的研究成為熱點,國外有學者使用米非司酮(Mife-pristone對卵巢癌耐藥細胞株進行體外細胞毒性試驗,結果發現5mol/L的米非司酮對細胞生長無影響,但使用該劑量的米非司酮能成功逆轉該細胞對多種抗癌藥的耐藥性13。本次實驗經過預實驗發現100mol/L和200mol/L濃度的西地那非同系物的逆轉效果較好。Elizabeth和Alica14在米非司酮對耐多柔比星人乳腺癌細胞MCF-7/AD體內外耐藥逆轉作用中試驗中測得MCF-7/AD細胞的耐藥倍數為

28、41倍。本實驗中MCF-7/AD細胞的耐藥倍數為1175倍,說明不同實驗當中建立的耐藥細胞體系存在較大差異,可能是由于原代細胞株對化療藥的敏感性不同和所用藥物抗癌效力不同導致。本實驗中XDNF1-0425在100mol/L和200mol/L時與多柔比星合用時MCF-7/AD的逆轉倍數分別為636和1183倍;而XDNF8-0113在100mol/L和200mol/L時與多柔比星合用時對MCF-7/AD的逆轉倍數為558和1347倍,提示XDNF1-0425和XDNF8-0113具有較好的逆轉作用;且在一定濃度范圍內XDNF1-0425和XDNF8-0113的逆轉效果隨濃度的增高而增強。同時作為

29、對照組的西地那非也具有較強的逆轉效果,其在100mol/L和200mol/L時與多柔比星合用時對MCF-7/AD的逆轉倍數為1544和2483倍;雖然本實驗所用西地那非同系物的逆轉倍數小于西地那非,但是其較小的副作用作為抗腫瘤細胞多藥耐藥的逆轉劑仍然具有很重要的臨床意義。實驗所選的人乳腺癌MD細胞株MCF-7/AD高表達P-gp蛋白15,P-gp蛋白是一種ATP依賴性的跨膜外流泵,它可通過細胞膜轉運多種抗腫瘤藥,從而限制這些抗腫瘤藥進入細胞而導致腫瘤細胞耐藥,因此介導腫瘤細胞多柔比星、長春新堿等藥物的耐藥16。我們推測XDNF1-0425和XDNF8-0113逆轉作用機制可能是抑制P-gp蛋白

30、介導的細胞外排作用,并通過流式細胞術證實100mol/L和200mol/L的XDNF1-042和XDNF8-0113可以抑制MCF-7/AD細胞P-gp蛋白的外排功能,從而實現逆轉MCF-7/AD細胞的耐藥性。綜上所述,人乳腺癌MCF-7/AD細胞對多柔比星耐藥,而西地那非同系物XDNF1-0425和XDNF8-0113對其耐藥性有顯著的逆轉作用,并且可抑制其P-gp糖蛋的外排功能。其逆轉作用在蛋白表達及基因調控方面的具體機制還有待進一步的研究。【參考文獻】1Detwiler A,Bloom P,Petersen A,et alMulti-drug and methi-cillin resis

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