1、穩(wěn)定表達丙型肝炎病毒單鏈絲氨酸蛋白酶的HepG2細胞克隆的建立                     作者：雷迎峰，尹文，薛小平，楊敬，呂欣，韋三華，胡興斌，孫夢寧，徐志凱【關(guān)鍵詞】  丙型肝炎病毒   Establishment of stably transfected HepG2 cell line expressing HCV scNS4A/NS3 protease【

2、Abstract】 AIM: To construct a eukaryotic expression vector of HCV single chain serine protease (scNS4A/NS3) and to obtain its stably transfected HepG2 cell line. METHODS:  According to the sequence of HCV scNS4A/NS3 gene from the literature, the primers amplifying the gene coding scNS4A/NS3 pro

3、tease were designed. HCV RNA was extracted from the HCV positive serum and the gene coding scNS4A/NS3 protease was amplified via RTPCR. The PCR product was digested by BamH/Hind and purified by gel extraction. This fragment was inserted into pcDNA3.1(-) with T4 ligase and transformed into E.coli JM1

4、09. The positive recombinant plasmid was selected and identified via sequence assay and restrictive enzyme digestion. The recombinant plasmid was then transfected into HepG2 cell by LipofectAMINE2000. The cells containing stable transformants were selected by the ability of resistance to G418. The s

5、tably transfected cell line was identified by RTPCR and IFA and Westernblot. RESULTS:  The eukaryotic expression vector named pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3 was successfully constructed  and the stably transfected HepG2 cell line which expressed scNS4A/NS3 protease was obtained. CONCLUSION:  T

6、he stably transfected HepG2 cell line expressing single chain serine protease facilitates the establishment of cellbased system in evaluating antiHCV serine protease drug.【Keywords】 hepatitis C virus; single chain serine protease; lipofectamine, transfection; colone cells【摘要】 目的：構(gòu)建丙型肝炎病毒單鏈絲氨酸蛋白酶（scN

7、S4A/NS3）的真核表達載體；建立重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細胞克隆. 方法：根據(jù)文獻報道設(shè)計擴增scNS4A/NS3編碼基因的引物，從HCV陽性患者血清中提取病毒RNA，RTPCR方法擴增出scNS4A/NS3基因片段， BamH/Hind雙酶切后連接到經(jīng)同樣酶切的真核表達載體pcDNA3.1(-)，轉(zhuǎn)化菌株JM109感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3，經(jīng)酶切鑒定及序列測定. 將陽性重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HepG2細胞，經(jīng)持續(xù)G418壓力選擇和克隆化獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，用RTPCR，IFA，Westernblot證實該穩(wěn)定細胞系可以表達單鏈絲氨酸蛋白.

8、結(jié)果：成功構(gòu)建了真核表達載體pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3；建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細胞克隆，命名為scpHepG2. 結(jié)論：獲得穩(wěn)定的scpHepG2細胞克隆可表達單鏈絲氨酸蛋白，為下一步建立以細胞為基礎(chǔ)的評價抗HCV絲氨酸蛋白酶藥物系統(tǒng)奠定基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】 丙型肝炎病毒；單鏈絲氨酸蛋白酶；轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體法；細胞克隆0引言穩(wěn)定、可靠的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和小動物實驗?zāi)Ｐ偷娜狈O大地制約著抗丙型肝炎病毒(HCV)研究的深入和發(fā)展1. 因此以在HCV RNA復制和蛋白前體加工成熟中起著關(guān)鍵作用的酶分子為靶位的測定系統(tǒng)常被用于抗HCV 藥物的篩選. 酶抑制劑作為一個有潛力的藥物分子，它不僅需要

9、有效，也需要有良好的藥物動力學等特征，如易進入細胞、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定. 所以建立一種可以在細胞水平上評價酶活性的細胞系統(tǒng)非常關(guān)鍵. NS3絲氨酸蛋白酶在HCV多聚蛋白前體加工成熟中起關(guān)鍵作用，是抗HCV研究的主要靶標分子2. 我們通過構(gòu)建HCV單鏈絲氨酸蛋白酶（scNS4A/NS3）的真核表達載體，獲得重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細胞克隆，為下一步建立以細胞為基礎(chǔ)的評價抗HCV絲氨酸蛋白酶藥物的系統(tǒng)奠定基礎(chǔ).1材料和方法E.coli. JM109菌株、pcDNA3.1(-)質(zhì)粒由本室保存. Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHI，Hind等購自TaKaRa公司，膠回收試劑盒購自Vgene公司，T

10、4 DNA連接酶購自上海生物工程公司，F(xiàn)ITC和HRP標記羊抗鼠IgG, DNA分子標準、低分子蛋白質(zhì)標準分別購自華美生物工程公司. 反轉(zhuǎn)錄試劑盒Superscript，Trizol，Lipofecatmine2000，G418購自Gibco公司. NS3mAb由本室制備3.1.2.1HCV RNA的提取與cDNA第一鏈的合成以HCV陽性患者的血清為材料提取病毒RNA，方法參照Trizol說明書，將RNA沉淀溶于20 L不含RNase的去離子水. 反轉(zhuǎn)錄按Superscript說明書進行，模板為病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄引物為scNS4A/NS3基因下游引物，最后獲得cDNA第一鏈.1.2.2scNS

11、4A/NS3基因的PCR擴增參考文獻4，設(shè)計擴增scNS4ANS3基因的引物: P1,5 CGGATCCATGGCGCCTATCGGCTCAGTAGTAATCGTAGGCAGAATCATCCTGTCCGGCCGTGGTGGCCCTATTACGGCCTACTCCCAAC 3; P2, 5 CGCGGTACCTAGGCAAAACCAGAACCAGC 3. 上述引物均由上海生工公司合成. 以病毒cDNA第一鏈為模板擴增scNS4A/NS3基因，體系為：模板5 L，10×Buffer 5 L ，10 mmol/L dNTPs 4 L，p1，p2各2 L，Taq 2 L，用超純水補至終體積50

12、 L. 條件: 預(yù)變性94 5 min，94 1 min，60 50 s，72 1 min共 30個循環(huán)， 72延伸10 min. 質(zhì)粒構(gòu)建按參考文獻5進行，獲得pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3重組質(zhì)粒. 酶切進行鑒定并交由上海生工公司測序.1.2.3細胞培養(yǎng)和G418工作濃度的確定常規(guī)培養(yǎng)HepG2細胞于12孔板中，50 mL/L CO2，37，培養(yǎng)基為RPMI 1640 (100 mL/L胎牛血清,100 mg/L青、鏈霉素,2 mmol/L谷氨酰胺)，至細胞密度達90%布滿時，加入含G418的培養(yǎng)液1 mL/孔（G418終濃度分別為2001000 mg/L，8孔）. 換液時保持

13、G418濃度穩(wěn)定不變，持續(xù)培養(yǎng)34 wk.1.2.4細胞轉(zhuǎn)染與篩選穩(wěn)定細胞克隆質(zhì)粒制備：將pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109，挑取菌落接種5 mL LB，37振搖，12 h后離心收菌. 用去內(nèi)毒素超純質(zhì)粒提取試劑盒（博大泰克公司）提取質(zhì)粒，紫外分光光度法測定DNA含量和純度. 細胞轉(zhuǎn)染：將HepG2細胞培養(yǎng)于24孔板，待細胞90%鋪滿，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3,具體操作按LipofectAMINE 2000說明書進行. 建立穩(wěn)定的細胞克隆：采用G418壓力選擇. 上述轉(zhuǎn)染48 h后，通過G418壓力篩選2 wk后，細

14、胞成團，用槍頭挑取單個細胞團種在96孔板，繼續(xù)加G418壓力選擇，直到最后獲得單獨穩(wěn)定生長的細胞克隆，擴大培養(yǎng)后檢測并凍存. 獲得的細胞克隆凍存2 mo后復蘇，檢測細胞克隆的穩(wěn)定性.         1.2.5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的檢測RTPCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中目的基因的mRNA： 將穩(wěn)定生長的細胞用PBS清洗一次后，參照說明書用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按SuperScriptTM II反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Gibco公司）操作說明進行. 用P1和P2對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR. PCR反應(yīng)體系

15、及反應(yīng)條件同前. 免疫熒光檢測：用胰蛋白酶消化穩(wěn)定生長的細胞，吹勻，將之加入鍍膜片小孔中，每孔15 L，置于濕盒中，37, 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，40 g/L多聚甲醛固定，NS3 mAb作為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG作為二抗，500 g/L的甘油封閉后在熒光顯微鏡下觀察. 同時以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1（-）的HepG2做為對照. Westernblot檢測目的蛋白的表達:在六孔板中培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞，待細胞鋪滿后，用PBS清洗細胞3次，然后每孔加入100 L 2×SDS上樣緩沖液，用細胞刮刀將細胞分離置于離心管中. 用細胞超聲粉碎儀破碎細胞，煮沸5 mi

16、n，離心收集上清備用，同時用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2做對照. 按Biorad垂直電泳儀說明書，配置40 g/L濃縮膠和120 g/L分離膠，取20 L細胞處理液上樣，電壓120 V，1.5 h后將蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜（NC），NS3 mAb作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，DAB顯色.2結(jié)果2.1PCR產(chǎn)物和重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果取PCR產(chǎn)物5 L行10 g/L瓊脂糖電泳結(jié)果顯示擴增出約590 bp的片段,大小與目的片段相符. 重組質(zhì)粒經(jīng)BamH/Hind酶切后，酶切產(chǎn)物大小與預(yù)期相符（圖1），說明重組真核表達載體構(gòu)建正確. 序列測定結(jié)果與文獻報道相同.2.2G418工作濃度的確定可觀察

17、到1000，900，800 mg/L孔于第2日，700和600 mg/L孔于第3日，500，400，300 mg/L孔于第5日，200 mg/L孔于第6日開始出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象，細胞開始溶解. 20 d后，G418濃度700 mg/L的各孔細胞穩(wěn)定生長，而1000，900，800 mg/L的3孔相繼全部死亡. 可以認為在本實驗條件下G418的最佳工作濃度為800 mg/L.2.3.1RTPCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的目的基因RTPCR產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖電泳. 可見在預(yù)期大小處（590 bp）有一條亮帶(圖2).2.3.2免疫熒光檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的目的蛋白在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光主要分布在

18、細胞質(zhì). 而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)的HepG2細胞綠色熒光為陰性(圖略).2.3.3蛋白印跡檢測目的蛋白DAB顯色后可見在預(yù)期大?。∕r 22 000）處有一特異條帶. 而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)的HepG2細胞沒有染出條帶(圖3).3討論HCV NS3蛋白編碼基因全長共1893個核苷酸. NS3蛋白近N端1/3 (1180aa)具有絲氨酸蛋白酶活性. 近C端2/3具有三磷酸核苷酶(NTPpase)和解旋酶(Helicase)活性6. NS3絲氨酸蛋白酶在四個連接區(qū)域切割多聚蛋白前體：NS3NS4A，NS4ANS4B，NS4BNS5A，NS5ANS5B. 隨著NS3絲氨酸蛋白

19、酶得到表達和純化，1996年Kim等7分別利用晶體衍射獲得了NS3蛋白及蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)，明確了酶活性所需的必需條件和輔助因子,其中NS4A中間的12個氨基酸是絲氨酸活性發(fā)揮必需的. Dimasi等8將NS4A核心區(qū)域通過連接子與NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域構(gòu)建為一條單鏈蛋白，經(jīng)原核表達后獲得的純化蛋白具有NS3絲氨酸蛋白酶的活性.本研究中，我們首先設(shè)計了擴增單鏈NS3絲氨酸蛋白酶的引物，上游引物中含有NS4A的核心區(qū)2143aa的基因序列，兩者之間設(shè)計了一個RGGP的連接序列，該序列可以形成片層結(jié)構(gòu)，從而使得NS4A能夠起到輔助因子的作用，這樣保證了單鏈蛋白具有良好的絲氨酸蛋白酶活性. 以HCV陽

20、性患者的血清為材料，提取病毒RNA，將之反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，擴增出了單鏈絲氨酸蛋白酶的基因序列. 用構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2，獲得單獨穩(wěn)定生長的細胞克隆，擴大培養(yǎng)后檢測并凍存. 我們用RTPCR方法和間接免疫熒光、蛋白印跡的方法，從基因水平和蛋白水平上檢測到單鏈絲氨酸蛋白酶在細胞獲得表達.本實驗結(jié)果表明，我們成功地構(gòu)建了包含HCV scNS4A/NS3基因序列的真核表達載體pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3，建立了其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細胞株，該細胞株能夠穩(wěn)定表達單鏈絲氨酸蛋白酶，為下一步建立以細胞為基礎(chǔ)的評價抗HCV絲氨酸

21、蛋白酶藥物的系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ).【參考文獻】1 張景霞,周紅超,徐德忠,等. HCV C區(qū)基因在SP2/0細胞及荷瘤小鼠瘤內(nèi)的表達J. 第四軍醫(yī)大學學報, 2002, 23(24):2236-2239.2 Hugle T, Cerny A. Current therapy and new molecular approaches to antiviral treatment and prevention of hepatitis CJ. Rev Med Virol， 2003, 13:361-371.3 Yang J. Expression of HCV NS3 protein, preparation of its Mabs and determination of their bingding region D. 第四軍醫(yī)大學研究生學位論文, 2005:56-58.4 Berdichevsky Y, Zem