1、乙型肝炎病毒基因組變異研究的幾個熱點問題nbsp;nbsp;nbsp;侯金林nbsp;nbsp;孫nbsp;nbsp;劍nbsp;nbsp;駱抗先nbsp;nbsp;廣州第一軍醫大學南方醫院nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;對乙型肝炎病毒(HBV)基因變異已進行了較為系統的研究，然而，仍有許多問題尚未解決。比如，HBV變異對臨床的影響到底有多大?新近認為幾 侯金林孫劍駱抗先廣州第一軍醫大學南方醫院對乙型肝炎病毒(HBV)基因變異已進行了較為系統的研究，然而，仍有許多問題尚未解決。比如，HBV變異對臨床的影響到底有多大?新近認為幾種類型的HBV變異株可能與臨床抗病毒治療有關：一些報告認為H

2、BV前C和C基因以及C基因啟動于變異可能與干擾素治療應答有關：而研究發現HBVP基因活性部位的變異可導致核苷類似物治療中的耐藥。這些問題已成為臨床醫生關注的焦點。一、乙型肝炎病毒血清型和基因型(一)概述乙型肝炎病毒亞型有aywl、ayw2、ayw3、ayw4、adw2、adw4、ayr、adrq+及adrq九種，已發現的HBV基因型有AH八種。研究HBV亞型與基因型的關系表明(見表1)，不同的亞型可屬同一基因型，而同一亞型又可分布于不同基因型。亞型并不能反映基因組的異質性。基因型概念的提出建立在測序的基礎上，故測序成為主要的鑒定基因型的方法。表IHBV亞型和基因型的關系HBV基因型HBV亞型A

3、型adw2和adwlB型adw2和aywlC型adr、ayr和adw2D型ayw2和ayw3E型ayw4F型adw4、ayw4和adw2G型adw2H型adw3基因型是指根據不同個體基因序列之間的規律性差異而分成的不同類型，它用來描述基因本身的特征。基因型分析可鑒定個體或病毒毒株之間的差異。以往根據HBV外膜生蛋白第122-134位氨基酸(dy決定簇)、第139-147位氨基酸(a決定簇)以及第159-160位氨基酸(wr決定簇)的變化，將HBV毒株分為四個主要血清亞型：adw、adr、ayw和ayr。基因序列的單個核酸的變化即可能改變血清亞型，放血清亞型不能反映基因的差異。根據HBV全基因序

4、列異質性=8的界線，可將其分為不同的基因型。目前，已鑒定的HBV基因型有AH八種，基因型與血清亞型之間的關系已被清晰論證。Ohba等通過對HBV全序列分析發現，在不同基因型之間S區段異質性最大，而型內S區段的異質性最小，從而可以根據S區基因序列異質性=4的標準代替全序列進行基因分型。在此基礎上，發展了一系列簡單、準確的分型方法，推動了HBV基因型的流行病學及臨床相關研究。HBV基因型的分布具有明顯的地理學特點，大體上如下：基因型A主要流行于美國及北歐國家；基因型B和C主要分布在亞洲及遠東地區；基因型D在世界各地均有發現,但主要分布于地中海地區；基因型E僅限于非洲；基因型F則分布在中美洲；剛鑒定

5、不久的基因型G和H的地理分布尚不清楚。(二)HBV基因型與病毒變異病毒變異是指基因型以外的序列改變，而基因型也是在漫長的歲月中變異積累形成的。可以推測，乙型肝炎病毒的某些變異位點與病毒基因型相關，許多相關研究也證明了這一點。Magnius等認為，基因型E、F在第140位氨基酸為絲氨酸特異替代，影響“a”決定簇區結構的穩定性，可能會導致第141位的賴氨酸變異為谷氨酸，使表面抗原的特性發生改變，產生免疫逃逸現象。前C區1896變異是基因型依賴的，在B、C、D和E型的G1896與T1858配對的干襻結構不穩定，1896的GA變異使干襻結構趨于穩定，故前C終碼變異率較高。而A和F型的1858位核苷酸為

6、C，能與1896位核苷酸C形成穩定的結構，較少發生變異。所以，前C區1896變異的流行率與基因型相關，這就造成HBeAg陰性HBV感染流行率與地區優勢基因型相關的現象，這一觀點已被廣泛論證。C基因啟動于(CP區)變異也與基因型相關。Chan等觀察了45名慢性肝炎患者，發現1858位核著酸為C的基因型(A、F基因型)較1858位核苷酸為T的基因型(B、C、D、E基因型)更易出現CP區變異。Orito等對50名HBVB和C基因型感染的病人研究發現，C基因型中CP區A1762T、G1764A雙突變發生率(58)顯著高于B基因型(16)。不同的基因型與某些變異相關，可能是不同基因型HBV感染后疾病表現

7、差異的分子生物學基礎，也可能影響著病毒對疫苗和藥物的反應。過去的研究提示，乙型肝炎病毒基因的變異可能會影響e抗原陽性慢性肝炎病人對a干擾素的應答，已進行研究的HBV基因區段包括A1896終碼突變、C基因啟動子變異及C基因變異。(三)HBV基因型與臨床結局乙型肝炎病毒主要通過宿主免疫機制引起肝臟損害，免疫應答的主要目標是HBcAg，由HLA工限制的CDS+T細胞識別并攻擊受感染的肝細胞引起炎癥，這個過程受包括宿主、病毒的多個因素影響。病毒基因異質性影響著抗原的表達，可能也從中扮演了重要的角色。較早時期，Shiina等研究了血清亞型與疾病表現之間的關系，在對1744名HBcAg攜帶者的調查發現，a

8、dr亞型(C基因型)較adw亞型(主要為B基因型)更易出現肝臟病變，提示HBV血清亞型或基因型在對宿主的致病性存在差異。Mayerat等比較了35例急性肝炎及30例慢性肝炎病人中的基因型分布，發現在慢性肝炎組中，A型占80(2835)，D型占11(435)；因急性肝炎組，D型占80(2430)，A型占10(330)。研究顯示基因型A與慢性肝炎相關，基因型D與急性發病相關，提示病毒基因型在病毒宿主相互作用中有一定差異，這可能是因為基因型A所產生的抗原性要弱于基因型D，誘導機體產生免疫清除的能力也較弱，導致感染遷延。Lindh等對東亞地區的43名基因型為B和C的HBV慢性感染者的基因型及CP變異的

9、研究表明，T1762變異更易出現在C基因型，感染C型后更易出現較重的肝臟炎癥。Kao等在臺灣做了一較大樣本的調查，用分子生物學方法鑒定100名無癥狀攜帶者及170名慢性肝病和肝癌病人中的基因型分布，發現C基因型在肝硬化及年齡大于50歲的病人中的流行率顯著高于無癥狀攜帶者；年齡分層分析顯示，35歲以下的肝癌病人中B型的感染率遠遠高于無癥狀攜帶者；另外，C基因型感染率隨年齡的增長而下降。結果提示C基因型要經過較長時間的免疫清除然后進入較嚴重的肝臟損害階段，而B基因型則經過較短的免疫清除進入較輕的病變階段。此外，在與肝癌的關系中，C基因型與5b歲以上的肝癌相關，而B基因型則與年輕的肝癌相關，具體的機

10、制尚不清楚。Tsubota等也發現在45歲以上肝硬化病人中，C基因型感染者的肝癌發生率要顯著高于B基因型感染者。來自上海的一份研究報告也顯示：感染HBVC基因型更傾向于較重的肝病和較大年齡的病人，感染B基因型則傾向較好的病變結局。由于病毒的基因控制著抗原的表達，不同的毒株出現某些變異的頻率不同，不同毒株對機體免疫清除抵抗力不同以及其它的因素可能導致了不同基因型具有不同的感染后疾病譜。從目前的研究來看，HBVC基因型與較重的肝臟病變相關，B型則與較輕的病變相關；A型與慢性肝炎相關，D型與急性自限型肝炎相關；其它基因型與疾病譜的關系還未有特殊發現。但是，由于基因型分布的不均衡和樣本大小的影響，還需

11、要作多中心大樣本的研究方能進一步了解基因型與疾病譜之間的關系。(四)HBV基因型與臨床治療感染不同的HBV基因型患者對臨床治療的藥物反應可能也不一致。這提示基因的本身影響著病毒對藥物的反應。丙型病毒性肝炎的研究發現，在對干擾素的應答中，HCV1型病毒最不敏感，治療時間要長于其它基因型。隨著長效干擾素的臨床應用和不同聯合抗病毒治療方案的推出和優化，乙型肝炎病毒(HBV)分子病毒學的特點與抗病毒治療的關系可能越來越引起臨床醫生的關注。HBV共分為AH七種基因型，不同的基因型具有不同的變異特點和地域分布特點，但不同的基因型的分子病毒學特點及對干擾素的應答情況并不明確。侯金林等對148例接受干擾素治療

12、的e抗原陽性的慢性乙肝病人(其中103例來自歐洲16個中心、45例來自中國廣州)進行分析，研究了干擾素。治療結局與HBV病毒學特點之間的關系，包括病毒基因型、引起e抗原表達水平下降的變異(前C和CP區)、C基因變異等。發現在歐洲病人中，最常見的基因型為A和D(A占45，D占34)。A基因型與非A基因型相比，A基因型對標準干擾素治療應答較好(p=0014)。多因素回歸分析發現，與基線HBVDNA和ALT水平相比，基因型A可作為更好的預測治療應答的指標(p：0001；相對危險度619，95置信區間194198)。相反，對尺療程的干擾素治療應答率在不同的基因型中沒有差別。對基線和治療結束時HBV序列

13、研究發現，只有A基因型在治療結束時CP變異率增高(P0001)。此外，與B、C或D基因型相比，C基因的氨基酶突變率在A基因型中發生率最低。HBV基因型A對標準干擾素治療應答率較其他基因型高，這與不同基因型的分子病毒學特點有關。感染不同基因型的HBV患者接受干擾素治療的合理療程也應不同。二、乙型肝炎病毒P基因變異與臨床1P基因結構與功能：1996年在臨床應用拉咪呋定治療的病例中首先發現HBV耐藥毒株的存在。目前認為HBV核苷類似物耐藥與HBV聚合酶基因變異有關，HBV多聚酶基因編碼末端蛋白、間隔區、反轉錄酶和RNA酶H。過去P基因氨基酸的命名是以P基因的起始密碼子開始，但由于不同的基因型P基因編

14、碼的氨基酸長度不一致，導致HBVP基因氨基酸的命名一直較為混亂。如基因型A的P基因編碼845個氨基酸，而基因型B和C的P基因編碼843個氨基酸，D基因型的P基因編碼842個氨基酸。這樣就導致了同一個氨基酸在不同的基因型中命名位置不一致。如YMDD中的M，在A基因型中命名為552，而B和C基因型中為550，D基因型為539，E和C基因型為549。這種命名的混亂導致不同的文獻報道結果不一致，不利于學者之間的交流。為了消除這種基因型之間的差異，最近有學者重新對P基因進行了命名，命名原規則如下：不同的HBV毒株P基因TP(末端蛋白)和間隔區在不同基因型中長度不一致，而所有HBV毒株的RT長度均為344

15、個氨基酸并起始于一個保守序列EDWGPCDEHG。基于這樣一個特點，對P基因CT區進行單獨命名。根據HIV研究的經驗，將HBVP基因的RT(逆轉錄酶)區分為AF六個區，目前已發現的耐藥株中P基因變異是多位點的，可伴于AE五個區中存在，還未發現F區耐藥變異的存在。A至F六個區分別為F區(37-47)；A(75-91)；B(163-189)；C(200-210)；D(230-241)；E(247-257)。2P基因聚合酶活性部位B區和C區變異與核苷類似物耐藥：由于人類免疫缺陷病毒(HIV)和HBV聚合酶結構的相似性，通過計算機模擬分析將HIV和HBV聚合酶基因分為假想的AE5個活性部位。P基因變異

16、主要見于長期應用拉咪呋定和泛昔洛韋的患者，目前已發現的耐藥株中P基因變異是多位點的，但相對集中于P基因酪氨酸蛋氨酸天門冬氨酸天門冬氨酸(TposineMethionineAsPartieacidAspatieAcid，YMDD)區域，突變為YI(異亮氨酸)DD或YV(纈氨酸)DD。不同的核昔類似物耐藥株的變異位點不一致，拉咪呋定耐藥株的P基因變異多位于B區和C區，其中以C區YMDD變異最為常見；而泛昔洛韋耐藥株的P基因變異多位于B區，兩者較少重疊，這對于設計使用不同的核著類似物有重要的指導意義。3乙型肝炎病毒核昔類似物耐藥性產生機制：目前體內外實驗均證明耐藥性的產生與P基因變異有關，但為何P基

17、因變異會導致HBV耐藥仍不清楚。大多數核苷類似物要先磷酸化為三磷酸形式，然后才能發揮抗病毒作用，其抑制HBV復制的機理主要是三磷酸化形式的核苷類似物可與正常核苷酸發生競爭性結合至延長中的DNA鏈，由于其缺乏3，OH，不能形成正常的3，5，磷酸二酯健，導致HBV復制的終止。HBV多聚酶是由P基因編碼的，從艾滋病病毒(HumanlmmunodeficiencyVirus，HIV)P蛋白的結構模型研究中發現，P基因特定部位的突變會直接或間接影響多聚酶活性部分，影響酶催化活性部分與模板鏈的結合，降低復制效率。由于HIV與HBVP蛋白結構的相似性，推測sHBVP基因突變會導致復制過程中核苷類似物摻人新生

18、鏈功能下降，鏈終止作用減弱，藥效降低，故產生耐藥。但其確切機制仍有待闡明。4拉咪呋定抗藥性耐藥與變異：核苷類似物需服藥一年以上，因此HBV對核苷類似物的耐藥不可避免。病人一旦有可能發生核苷類似物耐藥，合理觀察和處理非常重要。雖然，出現YMDD突變后多數病人沒有導致臨床癥狀加重，但是，多數病人隨著血清YMDD突變株的出現，HBVDNA水平反跳，ALT復升且漸趨向于治療前的基線值。體外試驗幾乎所有拉咪呋定耐藥林均有YMDD區域的變異，伴或不伴有其他位點的變異。此變異位點在HIV研究中早巳發現與拉咪呋定耐藥性有關。在HBV體外實驗中也證實P基因變異可導致耐藥性的產生Bartholomew等選擇其中一

19、位復發患者治療前血清和復發后血清在體外培養系統中感染肝細胞，用不同劑量的拉咪呋定抑制HBV復制，結果在治療前血清感染組，003mol1拉咪呋定即可抑制HBVDNA達94，而復發后血清感染組用30gmol1拉瞇呋定抑制HBvDNA才80，HBVP基因變異株對拉咪呋定的敏感性只有野株的145。Fischer等通過定點誘突技術構造了鴨肝炎病毒(DuckHepatitisBVirusS，DHBV)YMDD區域第512位氨基酸MV的點突變，突變后的DHBV在40umol1拉咪呋定作用下抑制病毒復制作用才80，而ZmoVl拉咪呋定抑制野株復制達92。發生率亞洲地區對357例拉咪呋定治療的慢性乙型肝炎中的5

20、8例進行長期治療隨訪研究，結果發現YMDD突變率隨著療程的延長而增加，在治療14年分別為17、40、55和67，發生YMDD突變者ALT和HBVDNA平均水平高于未發生的病例，但低于基線水平。39例出現YMDD的病例33發生HBeAg血清轉換和59出現ALT復常。結果說明盡管治療中發生YMDD突變，長期拉咪呋定治療仍取得明顯的療效。在廣州南方醫院接受拉咪呋定治療的198例慢性乙型肝炎和肝硬化患者，用藥時間從9個月36個月不等，對每例病人均定期收集其系列血清標本。發現其中20例出現臨床耐藥，即HBVDNA水平在治療過程中升高，從治療開始到出現耐藥的平均時間為13個月(9-31月)，對治療前后HB

21、VP基因進行測序發現，出現YMDD變異的有19例，其中感染單純YVDD變異株8例，單純YIDD變異株6例，5例為HBV野株和YMDD變異株混合感染，對這5例患者進行克隆后測序，發現一種新的突變株G518E和或G520C，目前正在深入研究該毒株的生物學意義。出現耐藥突變株后，所有患者均出現HBVDNA定量反跳，14例出現不同程度的ALT升高，病毒反跳后平均2個月出現ALT升高。研究發現治療前ALT水平、HBV基因型。前CCP變異均與耐藥的發生無明顯關系。在e抗原陽性患者，出現耐藥后ALT水平比治療前高。一般認為在大多數病人出現YMDD突變后HBVDNA仍持續低水平，繼續治療可維持臨床上的完全應答

22、狀態。隨著療程的延長，部分病例HBVDNA復升，可伴有肝炎急性發作，有的可發生HBeAg血清轉換。按照我國拉咪呋定專家指導小組意見，病人出現耐藥，目前無其它更為經濟有效的抗病毒方案選擇，可在嚴密觀察下繼續用藥，或加用改用干擾素治療。如出現ALT增高持續大于正常值10倍以上，或出現明確的膽紅素升高，臨床癥狀加重，應繼續用拉咪呋定，并加用其它護肝藥。特別是對于失代償肝硬化患者更不應隨意停藥。目前報告的拉咪呋定治療中或停藥后肝衰竭病例多數與治療病例選擇不妥或隨意停藥有關。比如新近中國醫學論壇報載載ClinlnfectDis上的拉咪呋定YMDD引起突變導致致命性亞大塊壞死1例。我們認為有條件的單位開始

23、抗病毒治療前盡可能進行肝活檢，確定肝組織病變程度，以減少抗病毒治療的盲目性。核苷類似物的上市，為我們提供了新的抗HBV藥物選擇。然而，我們必須重視這些藥物的耐藥性，應盡早出臺我國的抗病毒藥物使用政策，形成全國各級醫院參與的耐藥監測網絡，并選擇幾所中心城市大醫院成立標準化的病毒耐藥監測中心，定期通報HBV耐藥研究情況。國內外專業人員(含管理人員)應定期開會討論耐藥研究方面的合作。制定嚴格的抗病毒藥物使用制度，必須有合格專科醫師的處方，上級醫師對處方的審核，才可開始抗HBV治療。同時應嚴格掌握衛生部批準的使用適應癥。現階段對肝組織學正常的慢性無癥狀攜帶者不宜盲目急于使用核苷類似物進行抗病毒治療。隨

24、著抗HBV核著類似物的臨床應用，如何組織和發展核苷類似物HBV耐藥性監測計劃，并指導各級醫院和國家的抗HBV耐藥監測的規范和管理，正確認識核苷類似物耐藥性，這些問題已成為臨床醫師關注的焦點，研究HBV耐藥性對治療效果的影響可能有重要的臨床價值。到目前為止發現的HBV耐藥毒株大多為低復制毒株，YMDD突變后HBVDNA反跳在一些病例可引起肝炎活動加重。YMDD以外其它部位的突變很少，而且這些變異點的意義遠未闡明。正如抗生素的應用可以導致細菌耐藥性的產生一樣，一方面我們應該重視拉咪呋定耐藥性的研究，同時不應該由于拉咪呋定耐藥性的產生，否定拉咪呋定的療效。三、乙型肝炎病毒S基因變異1S基因及其編碼蛋

25、白的結構與功能：S基因位于核苷酸(nt)第155-833位，編碼226個氨基酸殘基的外膜主蛋白即HBcAg，后者是引起機體產生保護性免疫的主要成分，它有一個免疫優勢表位稱為“a”決定簇，在所有亞型中均存在。由被動免疫產生的抗體90是針對“a”決定簇，此種抗體可對所有亞型的HBV感染提供保護性免疫。“a”決定簇位于氨基酸124-147位，是HBV各亞型的共同決定簇，有一定的空間構型。“a”肽段中幾個、甚至單個氨基酸的改變，將破壞構型的穩定性，從而改變其抗原性和免疫原性。2S基因變異與免疫接種：國際上普通推廣的乙肝免疫接種可在相當大程度上降低HBV感染率，但盡管經過正規的主動及被動免疫仍出現一些個

26、例感染HBV，其原因之一是出現免疫逃避現象。最常見的是G145R變異，這種變異株較原型毒株有生存優勢，體外實驗證明了G145R突變株的免疫原性及與原型毒株抗HBS的結合力均發生明顯變化。此種變異株對動物有傳染性和致病性，同時具有免疫原性。對這一變異株的產生機制目前仍不明，有人認為這種變異株是母親體內的少數毒株經垂直傳播給嬰兒后，經免疫選擇成為嬰兒體內優勢株；也有人認為母親體內無這種突變株，是原型毒株在嬰兒體內免疫壓力下發生變異的結果。隨著疫苗的廣泛推廣，促使HBV發生變異的免疫壓力逐漸增大，變異發生機會增加，幸而G145R突變株表達的HBsAg還能為多數常規診斷試劑所檢出。3S基因變異與HBI

27、G預防移植后肝臟HBV感染：抗HBs可對易感者提供保護性免疫，國際上普遍用HBIG預防移植后肝臟再感染HBV。但近年來發現不少患者經HBIG治療后仍然感染HBV，經研究發現與HBVS基因變異有關，包括S基因第20、44、114、130、145、184和188位氨基酸等多處變異。結果還發現，HBIG治療持續時間的長短與S基因變異發生率之間有一定關系，可見HBIG造成的免疫壓力促進了S基因變異的發生。在這種免疫壓力消失后，這種變異株會逐漸消失，原型毒株成為優勢毒株，因此檢測此種狀態下發現的變異株，不同時間采樣可能獲得不同的結果。4S基因變異與HBsAg(一)HBV感染問題：中國是一個HBV高感染地

28、區，人群攜帶率為8-20，估計有13億HBsAg攜帶者。廣東地區，對抗HBc陽性的人群進行PCR檢測發現3人群屬于HBsAg陰性HBV感染者。在武漢地區進行的研究發現3040HBsAg陰性慢性肝炎或隱匿性肝硬化病人血清或肝組中存在HBVDNA。過去的研究發現HBV變異是導致HBsAg陰性HBV感染的原因之一。但沒有對這種變異的發生率及其對肝臟病情的影響進行研究。HBsAg()HBV感染是臨床及流行病學的一大難題，影響對HBV感染的診斷，導致臨床漏檢及獻血員篩檢錯誤。Lai等檢測了1471例HBsAg()獻血者，ALT升高者中HBVDNA陽性率達9，ALT正常中HBVDNA陽性率為05，可見HBsAg()HBV感染流行相當嚴峻。HBsAg()與診斷試劑的敏感性、HBsAg滴度等有關，此外還與HBVS基因變異有關。我們曾發現S基因密碼子第122和123位之間“a”決定簇前插入2個氨基酸或S基因密碼子第123和124位之間多編碼了3個氨基酸，此種變異導致HBsAg抗原性發生改變，常規酶聯免疫