1、PCR儀常見問題及回答1. cDNA產(chǎn)量的很低可能的原因：* RN模板質(zhì)量低*對(duì)mRN濃度估計(jì)過高*反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足*同位素磷 32過期*反應(yīng)體積過大，不應(yīng)超過50 12. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒有條帶或條帶很淺*最常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR勺反應(yīng)體系而不是RT-PCR勺反應(yīng)體系*與反應(yīng)起始時(shí)RN的總量及純度有關(guān)*建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照 RNA*第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PC擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過 1/10 *建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物(GSP)用于第一鏈合成。由于 RNAI板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GS無法與

2、模板退火；或SSU反 轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進(jìn)行有效延伸。a.b.目的mRN中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決： 將第一鏈的反應(yīng)溫度提高至50C。使用隨機(jī)六聚體代替 Oligo(dT) 進(jìn)行第一鏈反應(yīng)。3.*產(chǎn)生非特異性條帶用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DN污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR吉果也顯示同 樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。*在PC反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5C的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA勺量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn) 生。*由于mRN剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的 RT-PC結(jié)果。4. 產(chǎn)生彌散

3、 (smear) 條帶*在PC反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過高*減少引物的用量*優(yōu)化PC反應(yīng)條件/減少PCR勺循環(huán)次數(shù)*在用DNases理被DN污染的RN/樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異 性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶 大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的*對(duì)于長片段的PCR建議將反應(yīng)體系中cDNA勺濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)6. 在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對(duì)照RN獲得擴(kuò)增結(jié)果*通常是由于對(duì)照RNA中含有痕量DNAS導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所 有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDN稀釋1:10、1:10

4、0、1:1000倍以消除DNA 污染所造成的影響。有可能是引物二聚體的條帶7. 擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中*有可能是由于模板量過高而導(dǎo)致PCR吉果產(chǎn)生了高分子量的DN膠狀物。建議將 第一鏈結(jié)果至少稀釋 100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增。Tms低5C,可以將退火溫度*另外，在二次PC時(shí)使用的退火溫度如果比引物的 適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。8. SS m與SSU有何不同？*具有更高的熱穩(wěn)定性(達(dá)50 C) *具有更長的半衰期 (達(dá)220分鐘) *對(duì)PC無抑希y*干冰運(yùn)輸？SSE則更穩(wěn)定。* Tdt活性更低9. 為什么有人更喜歡用SSM而不是ThermoScriptThermoScript 如果保存不當(dāng)會(huì)

5、引起活性很快降低,10. 為什么使用基因特異性引物 (GSP)？GS在擴(kuò)增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時(shí)是最好的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNAi全長 轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄；隨機(jī)引物用于mRN片段的逆轉(zhuǎn)錄。11. 什么情況下需要使用 RNase H？在第一輪PC中RNA/DN雜合體不能正常變性時(shí)12. 根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：目的建議RT與 PC使用不同的引物或需要靈活選擇PCR DN聚合酶兩步法RT-PC系統(tǒng)高靈敏度一步法或兩步法RT-PC系統(tǒng)高特異性含有適當(dāng)?shù)腄NAg合酶的兩步法RT-PC系統(tǒng) 或具有高保真Plat in um Taq酶的一步法RT-PC系統(tǒng) 高保真度含有Pfx Taq酶的兩步法

6、RT-PC系統(tǒng)長的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果通常使用兩步法RT- PC系統(tǒng)可達(dá)到最佳結(jié)果 含Elongase酶的一步法RT-PC系統(tǒng) 二、 Generacer1. 如何針對(duì)Gen eracer試劑盒設(shè)計(jì)基因特異性引物(GS P)?使用5或3'AC試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意 以下幾點(diǎn)要求：* 50-70 %的G(含量，以提高引物熔點(diǎn)(Tm)* 23-28個(gè)堿基長度，以提高引物特異性*降低3端G(含量，將引物非特異性結(jié)合的可能性降至最低2. 為什么得不到RACE?物？*加入Hela對(duì)照*低質(zhì)量的rnAI板*逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長模板cDNA勺合成*目的基

7、因豐度太低，可以通過提高 PCR勺循環(huán)次數(shù)來解決，建議使用巢式 PCR *目的基因沒有表達(dá)，可以通過使用兩條 GSP來分析cDNZ中是否含有目的基因*目的基因太長而不適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建議使用 Gen eRace試劑盒中的Oligo dT 來得到全長cDNA使用隨機(jī)引物或與模板的5端盡可能近的GS進(jìn)行PCR* cDNAg板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優(yōu)化 PC反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體 系；降低退火溫度；使用5-10 %的DMS幫助通過高G（含量區(qū)；使用高保真度和高 延伸能力的酶進(jìn)行PC反應(yīng)。3. RACE的PCR吉果有雜帶RACE PC雜帶或非特異性PC條帶可能是由于以下原因：* GS與其他cD

8、NA勺非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致在擴(kuò)增目的產(chǎn)物時(shí)得到無關(guān)產(chǎn)物。* Gen eRace引物和cDNA勺非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一端帶有 Gen eRace引物序 列的PC產(chǎn)物。* RN降解。* PCRf或試劑污染。注意：雜帶一般是因?yàn)闆]有優(yōu)化PC條件，可以加入陰性對(duì)照來確定。4. 得不到全長的5'ACE PC產(chǎn)物* CIP反應(yīng)后的RNAt解產(chǎn)生了新的帶有5磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacerRNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNAc降解。* CIP脫磷酸不完全，可以增加反應(yīng)中CIP的量或減少RNA勺量。* PC產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR三、PCR在進(jìn)行PC時(shí)：*請(qǐng)確保您沒有使用過量的起始 DNAE者過高濃度的引物，也沒有加入過量的Mg+*請(qǐng)確保您使用了恰當(dāng)?shù)耐嘶饻囟?請(qǐng)確保您沒有使用過量的DNA聚合酶 四、引物1. 應(yīng)該選擇哪種純化方法？ 取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵锏拈L度2. 為什么我訂購了 50nmol,但是收到卻只有40nmol?50 nmol是起始量3. 怎樣制備100 uM的儲(chǔ)液？體積（卩I）質(zhì)檢報(bào)告上的nmol數(shù)目X 104. 怎樣設(shè)計(jì)引物？一般長度 20-30bp；*至少50%勺G（含量；*避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)；