1、基因治療的應用及研究進展張峰1,2,霍金龍1,2,曾養志1,21.云南省版納微型豬近交系重點實驗室,云南昆明650212;2.云南農業大學動物科學學院,云南昆明650201摘要基因治療是一種新的治療手段,可用于癌癥、遺傳性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等的治療。癌癥基因治療是基因治療的主要應用領域。過去幾年里,全球基因治療臨床試驗取得了很大的進步,也遇到了很多困難。未來基因治療的主要目標是發展安全和高效的基因導入系統,它們能將外源遺傳物質靶向性地導入特異的細胞。簡要綜述了基因治療研究和應用的進展、困難及其發展前景。關鍵詞基因治療;體內療法;體外療法中圖分類號Q789文獻標識碼AR

2、esearch Advances and Application on the Gene TherapyZHANG Feng1,2,HUO Jin-long1,2,ZENG Yang-zhi1,21.Banna Mini-pig Inbred Lines Key Laboratory of Yunna Province,Kunming650212G2.Faculty of Animal Science,Yunnan Agricultural University,Kunming650201L ChinaAbstractGene therapy is a new therapeutic tool

3、 for the treatment of diverse types of diseases,including cancer,con-genital genetic,infectious,cardiovascular and autoimmune diseases.Cancer gene therapy is the main studied application of gene therapy.In the last few years,significant advances have been made in the clinical trials about gene thera

4、py world-wide.But some problems still need to be solved.In the future,the main objective in gene therapy is the development of safe and high efficient gene delivery systems that can deliver foreign genetic materials into specific cell types.The main studying advances in the area of gene therapy achi

5、eved recent years were reviewed,and the problems in this field that people have to face in the future were put forwards.Key wordsgene therapy L in vivo9ex vivo文章編號:1009-0002(200704-0677-03綜述1基因治療概述基因治療是指將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞,以糾正基因缺陷或者發揮治療作用,從而達到治療疾病的目的。廣義的基因治療是指利用基因藥物的治療,而通常所稱狹義的基因治療是指用完整的基因

6、進行基因替代治療,一般用DNA序列。基因治療常用方法有2種,即體內療法(in vivo和體外療法(ex vivo,主要的治療途徑是體外基因治療,即在體外用基因轉染病人靶細胞,然后將經轉染的靶細胞輸入病人體內,最終給予病人的療效物質是基因修飾的細胞,而不是基因藥物1,2。體內療法是將外源基因導人受體體內有關的器官組織和細胞內,以達到治療的目的。這些基因藥物可以是完整基因,也可以是基因片段(包括DNA或RNA;可以是替代治療,也可以是抑制性治療(包括DNA轉錄水平和mRNA翻譯水平。基因藥物不但可用于治療疾病,而且可用于預防疾病。這類基因藥物療法簡單易行,發展迅速,新型基因藥物也不斷產生3。基因治

7、療目前主要用于治療那些對人類健康威脅嚴重的疾病,包括遺傳病(如血友病、囊性纖維病、家族性高膽固醇血癥等、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病、類風濕等等4。2基因治療的應用研究進展2.1pRNA-納米技術在分子基因治療中的應用RNA可以用作從小到大構建納米體系的材料5。RNA沒有結合蛋白質的時候,具有非常低水平的或者不易檢測到的免疫原性。因此,利用從小到大的技術組裝構建的RNA納米粒子克服了上述問題,這樣構建的藥物輸送系統不含蛋白質或多肽,只有25nm,能避免免疫反應,可以在慢性病的治療中長期給藥,具有重現性;同時,它的大小適中,避免了過小分子(<20nm滯留期短、過大粒子(>

8、;100nm難以輸送的缺點。而多樣性使RNA 納米微粒能夠運載多價治療分子以增強治療效果,使用一個復合體來執行多個分子的功能,將有助于避免治療中可能出現的多重不良反應,借以發展一種新的特異治療策略。研究證明,二聚體產物可以將治療性RNA藥物特異性地輸送到特定細胞6,并可利用pRNA三聚體的形成機制來實現3個成分的共輸送。以六聚復合體形式達到6種成分的共輸送也是有可能的,因為pRNA可形成六聚體7。由于六聚體由6個pRNA組成,因此,有收稿日期2006-11-03基金項目國家高技術研究發展計劃重點資助項目(2003AA205009 作者簡介張峰(1982-,男,碩士研究生通訊作者曾養志,(E-m

9、ailbnwxzjjx6個可以用來攜帶細胞識別分子、治療分子、檢測分子的位點。六聚體RNA復合體的第1個單體,可被修飾來連接RNA適體(ap-tamer,能結合特異細胞表面受體,由此誘發受體介導的胞吞作用。第2個單體可以連接熒光染料、重金屬、量子點(quantum dots、熒光珠(fluorescent beads或放射性同位素,作為檢測癌細胞發育的不同階段的信號。六聚體的第3個單體可以添加降解內體(endosome的化學物,以促進小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA在輸送入核內后從內體的釋放,從而增強治療的效果。第4個單體可以連接核苷酸衍生物,如2-氟-2-

10、脫氧-CTP、2-氟-2-脫氧-UTP或錳鐵化合物,以穩定體外的RNA轉錄產物,防止RNase的降解8。第5個單體則連接治療siRNA、核酶、反義RNA或其他藥物。六聚體的第6個單體可以被設計來檢測細胞凋亡。這一多價復合物同樣可能通過識別被感染細胞表面特有的病毒糖蛋白來治療慢性病毒感染性疾病,如艾滋病和乙型肝炎。而且,目前已闡明RNA通常不誘導可察覺的免疫反應,除非它與蛋白質結合。因此,RNA作為藥物輸送載體的好處是避免了藥物長期使用可能引起的免疫反應問題,以及蛋白質載體的排斥問題。而這樣一個RNA復合物僅25nm,因此其在體內滯留時間更長。而且,該pRNA分子的毒性或其他不良反應可通過與小的

11、DNA聚合物結合進一步減輕。2.2以siRNA為基礎的基因治療雖然siRNA在哺乳動物細胞中的應用不很廣泛,但它正以飛快地速度發展成為基因治療的一種新方法。如果siRNA通過尾靜脈高壓注射能有效到達肝臟,那么它將可以廣泛用于治療各種肝病9。通過沉默肝中內源性凋亡基因的表達,經抗凋亡酶Caspase-8或抗Fas細胞死亡受體的siRNA預處理的小鼠能有效預防各種試劑誘導的急性肝功能衰竭,用同樣的siRNA也能治療已經發生的肝損傷10。siRNA通過抑制病毒自身或者抑制病毒轉錄所必需的輔助因子,還能達到抗病毒的目的。將乙型肝炎病毒(HBV基因組和siRNA共轉染,可以有效降低HBV的復制水平和蛋白

12、合成11。Wohlbold證明,用siRNA能有效沉默異常BCR-ABL融合基因的表達,而不影響正常c-BCR和c-ABL的轉錄,這為治療Ph染色體陽性的慢性粒細胞白血病提供了新方法12。在血漿中,siRNA雙鏈能抵抗核酸內切酶的降解作用,但這并不意味著其能夠穩定地存在于機體內13,因為未被修飾的siRNA不能迅速進入細胞內,或者與血漿蛋白親和力低而較早地被機體清除。如果不是通過表達siRNA載體的方法,那么必須經過化學修飾的siRNA才能更有效地作為基因治療的手段14。有研究正通過硫磷酰修飾siRNA提高細胞的攝取能力,從而增強基因沉默的效果15。2005年美國食品藥品管理局(FDA已批準經

13、過修飾的siRNA進行臨床新藥試驗,用于治療與年齡相關的黃斑退行性改變(age-related macular degeneration的患者。最近, Soutschek經鼠尾靜脈注射膽固醇修飾的抗apoB siRNA,能有效沉默同源性靶基因的過度表達,并且證實經修飾的抗apoB siR-NA導致小鼠膽固醇水平降低的程度與apoB基因敲除小鼠的水平相近,這實現了siRNA作為靜脈注射性治療藥物的可能。2.3干細胞應用于基因治療的研究進展1994年Snoopaa等16報道,胚胎心肌細胞植入正常心臟后可長期存活。給植入的細胞轉染了融合基因-肌球蛋白重鏈基因啟動子和-半乳糖苷酶報告基因,心肌細胞可表

14、達許多對心肌有益的產物,如轉化生長因子(TGF、成纖維細胞生長因子(FGF和血管內皮細胞生長因子(VEGF等,使植入的心肌細胞更有利于壞死心肌的修復;2個月后發現移植細胞仍然存活且和受體心肌細胞形成閏盤結構。從此,干細胞的基因治療被應用于心肌梗死的動物模型中。Matsumoto等17用腺病毒作載體,把人的VEGF165轉染于Lewis鼠的間充質干細胞(MSC中,然后連同MSC注入同源的心肌梗死1h以后鼠的模型中,并設對照組,1周后在心梗區域可以找到MSC,同時檢測到實驗組的VEGF高表達;28d后,無論是心梗的范圍、左室的容積、射血分數、E/A和心梗區域毛細血管的密度,實驗組都明顯優于對照組。

15、同時,通過免疫組化分析,在實驗組發現了平滑肌細胞和肌動蛋白陽性細胞。實驗證實了干細胞移植聯合基因治療是治療急性心肌梗死的有效方法。Song等18研究發現,MSC對損傷的心肌有潛在的修復作用,但是移植的MSC的存活能力低下。為了減少細胞的損失,用FGF 轉染MSC作為移植細胞,在體外培養。2周后95%以上的細胞表達CD75,28%的細胞表達心肌特殊轉入因子Nkx2.5和-骨骼肌肌球蛋白GATA4。然后把FGF-2基因轉染MSC,發現FGF的分泌增加,Bcl2抗凋亡基因增加,同時MSC的成活數量增加3倍。在心梗的區域注射5×109的轉染FGF的MSC,可以存活4周,而且象心肌一樣表達肌鈣

16、蛋白,產生有功能的腎上腺素受體,梗死區域的新生血管也增加。由于轉染FGF的MSC的存活率明顯上升,新生血管增加,所以得出FGF轉染MSC有利于心肌梗死和終末期心衰的結論。3基因治療的一些問題3.1理想載體的選擇一個理想載體需要有高效的轉移率,能將外源基因定向導入靶細胞,能轉導不分裂的細胞,能穩定整合到宿主染色體上。反轉錄病毒和腺相關病毒(AVV可以整合到宿主基因組,其轉導率幾乎可達100%,并可獲得持續的表達。反轉錄病毒載體作為基因轉移研究中的基因轉移系統有許多優點,是目前基因轉移技術中最常用的,也是成功率最高的。但是反轉錄病毒與其他病毒相比又是不穩定的,純化和濃縮后的反轉錄病毒會明顯喪失感染

17、能力,這都限制了反轉錄病毒在活體內應用的進一步開展。至于腺病毒,在離體情況下可獲得高表達,也能維持一段時間,但它的作用機制還不是很清楚,而且它在體內的復制將引發對安全性的考慮。另外,它的重復感染所引起的免疫反應也是必須考慮的問題。不過,腺病毒可以整合到不分裂的細胞中去,而這正是反轉錄病毒所不能做到的。腺相關病毒的整合效率不及反轉錄病毒,但最近的研究表明,它可直接注射于患者體內,攜帶基因產生表達產物治療疾病。有人把攜帶有因子基因的腺相關病毒注射到一個患有B型血友病的病人肌肉中,產生了較好的效果,對它的進一步研究正在進行中。單純皰疹病毒在中樞神經系統疾病中特別有用,但其復雜的復制特性和很難獲得重組

18、病毒的原液,均限制了其應用前景。由此看來,利用病毒并結合物理方法是構建理想載體的方向。3.2細胞的選擇由于病毒載體的各個特定序列往往與特異的細胞因子結合,因而靶細胞類型直接決定載體的表達效率及存在狀態。不過,該過程的詳細機制至今仍未闡明。骨髓細胞是最被重視和最常用的靶細胞,這是由于骨髓移植(BMT有如下優點:骨髓組織易于接受各種處理;多年來應用身體或異體BMT治療血液病和惡性腫瘤已累積了豐富的經驗;許多已知的遺傳病都或多或少涉及到源自骨髓的細胞;源自骨髓的細胞(如血細胞、組織巨噬細胞等遍布全身,幾乎存在于所有的器官和組織中,因而有可能應用經基因工程改造過的骨髓細胞來治療一些并不直接與骨髓細胞有

19、關的遺傳病。但骨髓細胞作為基因治療的靶細胞,也有一些缺點:必須用基因工程改造骨髓干細胞,才能得到穩定的持久的治療效果,但干細胞含量很少,僅占骨髓細胞的0.1%左右;治療基因在用核骨髓細胞中的表達時間太短,不超過幾個月,對于人的基因治療來說實在太短了;只有部分干細胞具有活性,因而治療基因是否有效取決于是否大部分活性干細胞含有該基因;骨髓造血干細胞的分化可能導致基因的失活;有的遺傳性疾病與骨髓細胞完全無關。3.3目的基因的高效表達經過多年的發展,人們已經發現了多種基因表達載體及有效的基因轉移途徑,但高效的表達問題一直困擾著大家。基因的高效表達是一個非常復雜的問題,它受DNA拷貝數、轉錄有效性、mR

20、NA的加工轉移和穩定性、翻譯有效性,以及蛋白質加工、分泌及穩定性等因素的影響,而且不同基因高效表達的限速因素又不一致。因此,提高目的基因表達的手段不僅限于表達載體調節成分的設計,人工改造基因使之協調于調節順序及宿主細胞也是一個重要的趨勢。4基因治療的應用前景高效表達載體和適用于臨床的基因轉移方法是決定基因治療成功的基礎,在體內精密調控目的基因的表達是決定基因治療成功的關鍵,基因治療的安全性是決定基因治療成功的保證。基因治療的發展已取得了巨大成就,它已被看成是對先天和后天基因疾病的潛在的、有效的治療方法,不過它依然存在缺少高效的傳遞系統、缺少持續穩定的表達及宿主產生免疫反應等問題。今后基因治療研

21、究將向2個方向發展:其一是基礎研究更加深入,以解決在臨床應用中遇到的一些困難及基因治療本身需要解決的一些難點(如靶向性差、可控性弱、目的基因少等為主要研究內容;其二是臨床項目增多,實施方案更加優化,判斷標準更加客觀,評價效果更加精確。成功的基因治療應以安全、有效、簡便、實用為目的。隨著人類基因組計劃的順利實施和完成,以及新的人類疾病基因的發現和克隆,基因治療研究和應用將不斷取得突破性進展。從理論上看,基因治療的著眼點必須從整體的系統觀點出發,始終著眼于局部與整體、整體與外部環境的相互聯系、相互作用、相互制約的關系19。基因治療最終要落腳于人類疾病的治療,但基因治療是一種新技術,在理論和技術方面

22、尚有一些關鍵問題急須發現和解決。有人提出,為了最大限度地保護病人,基因治療應采用“優后原則”,即當其他傳統療法無效或微效時,再使用基因治療,安全性是基因治療首要解決的問題。開發一種能高效轉移基因、表達高度組織特異性、能進行精確控制表達的理想載體是關鍵的突破口。目前病毒載體由于插入后不穩定因素太多,雖然表達較穩定,但終究要逐漸被方興未艾的非病毒載體所取代。雖然對各種新載體的研究尚不健全,且大部分是體外研究,而體內外環境差別很大,但科學從不會放棄任何有希望而又有可能的嘗試,要開發出更安全、有效的非病毒載體,還需要漫長的理論創新和技術突破,這并不妨礙人們對它們成為理想的基因治療載體寄予厚望。參考文獻

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