1、重組人血管內(nèi)皮生長因子D誘導雞胚尿囊膜血管增生    作者：陳浩丁秀云高媛柳曉蘭高建恩孫啟鴻    【摘要】 為了表達和純化具有生物學活性的人血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)?D，探討VEGF?D對血管增生作用，從人胎肺組織中提取總RNA，設計特異性引物并應用RT?PCR法擴增VEGF?D成熟肽片段；經(jīng)測序證明目的片段序列正確后，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX?5X?1/VEGF?D并在大腸桿菌BL21（DE3）中進行GST?VEGF?D融合蛋白的表達。結(jié)

2、果表明，融合蛋白的分子量約為38 kD，表達量占菌體總蛋白的15%以上，抗GST和抗VEGF?D的抗體均能識別融合蛋白；純化的GST?VEGF?D融合蛋白與VEGFR?3/Fc具有結(jié)合活性，并能刺激紅白血病細胞系HEL細胞生長；在雞胚尿囊膜實驗中GST?VEGF?D具有促進雞胚尿囊膜血管生成的作用。結(jié)論：成功表達了具有生物學活性的重組人VEGF?D融合蛋白，為進一步研究VEGF?D的作用機理提供了實驗模型。    【關(guān)鍵詞】 血管內(nèi)皮生長因子D；血管內(nèi)皮生長因子受體3；雞胚尿囊膜；血管生成 Recombinant Human VEGF?D Induces

3、 the Angiogenesis of the Chick Embryo Chorioallantoic Membrane    Abstract    Vascular endothelial growth factor?D (VEGF?D) and vascular endothelial growth factor receptor?2,?3 (VEGFR?2,?3) with their corresponding signaling pathway play significant roles in t

4、he development of the embryonic vascular system and pathological lymphangiogenesis. The study was aimed to express and purify the GST?VEGF?D fusion protein, and to explore the angiogenesis effect of VEGF?D. The total RNA was extracted from human fetal lung tissue, and the mature form of VEGF?D was e

5、xpanded by polymerase chain reaction (PCR), then the plasmid pGEX?5X?1/VEGF?D was reconstructed and the GST?VEGF?D fusion protein expressed in transformed E.coli BL21?DE3.The results showed that the molecular mass of this fusion protein was 38 kD and compassed more than 15% of the total bacteria pro

6、teins.The fusion protein was recognized by anti?GST and anti?VEGF?D antibodies.The soluble GST?VEGF?D fusion protein could interact with VEGFR?3/Fc and was able to stimulate the proliferation of human erythroleukemia cell line（HEL） cells. The data of chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) exper

7、iments indicated that GST?VEGF?D could induce the CAM angiogenesis. It is concluded that the GST?VEGF?D fusion protein with biological activity was successfully expressed, and which may provide an experimental model for the investigation of the VEGF?D?induced angiogenesis and lymphangiogenesis. 

8、;   Key words    VEGF?D;VEGFR?3; angiogenesis; chick embnyo chorioallantoic menbreme    腫瘤轉(zhuǎn)移通常是人類癌癥致死的主要原因之一。目前認為，腫瘤轉(zhuǎn)移的通路主要有以下三種方式：第一，腫瘤細胞浸潤血管，直接進入血道形成轉(zhuǎn)移灶；第二，通過侵入已存在的淋巴管進入淋巴循環(huán)系統(tǒng)，進而通過淋巴?血循環(huán)轉(zhuǎn)移到新的組織中形成轉(zhuǎn)移灶；第三，腫瘤細胞從實體瘤上脫落，直接種植到周邊組織形成轉(zhuǎn)移。在這些過程中，腫瘤細胞分泌各

9、種生長因子，刺激腫瘤生成新生血管和淋巴管（lymphangiogenesis），進而促進惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移，其中血管內(nèi)皮生長因子家族(vascular endothelial growth factor family， VEGF)及其受體血管內(nèi)皮生長因子受體 (vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)信號系統(tǒng)在腫瘤血管發(fā)生和淋巴管發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 5 種VEGF：VEGF?A、B、C、D和胎盤生長因子（placenta growth factor，PIGF)。這些VEGF能選擇性地與膜上的3種受體VEGFR?1(

10、Flt1)、VEGFR?2(KDR) 和 VEGFR?3(Flt4)中的1種或2種作用，促進血管增生和（或）介導淋巴管的增生1。 VEGF?A和VEGF?B能與VEGFR?1、VEGFR?2結(jié)合，刺激血管內(nèi)皮增生并增加血管通透性，在血管新生（vasculogenesis）和血管增生（angiogenesis）過程中起重要作用2。VEGF?C和VEGF?D是近年發(fā)現(xiàn)的與淋巴增生相關(guān)的因子，VEGF?C與VEGFR?2和VEGFR?3作用促進腫瘤淋巴管發(fā)生和轉(zhuǎn)移3,4。VEGF?D與VEGFR?3和VEGFR?2結(jié)合，不僅促進淋巴管的生成而且促進血管生成和發(fā)生4,5。  

11、60; VEGF?D以前體的形式合成，在結(jié)構(gòu)上與VEGF?C高度同源，經(jīng)過翻譯后加工去掉N?端和C?端多肽，成為含有VEGF同源區(qū)（VEGF homology domain, VHD）糖蛋白的成熟形式，提高了與VEGFR?2，VEGFR?3的結(jié)合能力6。本研究從人胎肺組織中克隆VEGF?D基因的VHD片段，在大腸桿菌中進行表達，生物學活性檢測結(jié)果表明重組GST?VEGF?D不僅具有與VEGFR?3/Fc結(jié)合的活性，還具有刺激紅白血病細胞系HEL細胞生長和促進雞胚尿囊膜（CAM）血管生成的作用。    材料和方法   

12、; 主要試劑    pGEX?5x?1表達載體和抗GST單克隆抗體均為Amersham公司產(chǎn)品；大腸桿菌BL21（DE3）菌株購自Novagen公司；GST預裝柱及相關(guān)的純化設備為Amersham公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和pGEM?T連接試劑盒均購自Promega公司； 各種限制性內(nèi)切酶購自Takara公司；抗VEGF?D單克隆抗體購自R&D system公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG為中杉金橋公司產(chǎn)品；HEL細胞購自中國醫(yī)學科學院細胞庫；MTT為Sigma公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。 &#

13、160;  VEGF?D目的片段（VHD）的獲得和重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建    根據(jù)VEGF?D的VHD片段的編碼序列，設計合成PCR反應引物：正向：5CCGGAATTCTTTGCGGCA ACTTTCTATGACATTG 3；反向：5 ATAAGAA TGCGGCCGCTCTTCTGATAATTGAGTATGGATGG 3。從人胎肺組織中提取總RNA，用Invitrogen公司的Transcript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用PCR反應從cDNA擴增目的片段。反應條件：94 30秒，58 30秒，72 1分鐘，進行30個循

14、環(huán)。PCR產(chǎn)物純化后連入T載體。測序正確后，分別對載體pGEX?5X?1和連有目的片段的T載體進行Not和EcoR 雙酶切，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX?5X?1/VEGF?D，應用菌落PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒。    GST?VEGF?D融合蛋白在大腸桿菌中的表達    將pGEX?5X?1/VEGF?D重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，挑取含pGEX?5X?1/VEGF?D質(zhì)粒的單菌落接種于含氨芐的LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)過夜。按1%接種量轉(zhuǎn)接到含氨芐的新鮮2YT培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約為0.5-0

15、.8,加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L，30繼續(xù)培養(yǎng)3小時后收集菌體。10% SDS?PAGE分析融合蛋白表達情況。    收獲的菌體重懸于pH 7.3的PBS中，于冰浴中超聲破碎細胞，向超聲破碎后的溶液中加入20% Triton X?100至終濃度1%，冰浴30分鐘，10 000×g離心收集上清和沉淀。10% SDS PAGE 進行檢測。    重組GST?VEGF?D融合蛋白的純化    按GST預裝柱參考說明書步驟進行。簡述如下：用兩倍柱體積的結(jié)合緩沖

16、液平衡后，取5 ml過濾后的樣品上樣；流速約為0.2 ml/min，用5倍結(jié)合緩沖液洗滌；洗脫液洗脫，流速為1 ml/min。洗脫組分用SDS?PAGE進行分析鑒定。合并目的蛋白組分，雙蒸水透析，透析后的樣品用冷凍干燥機干燥，-20保存。    Western blot鑒定    融合蛋白分別用抗GST抗體(11 000)和抗VEGF?D單然隆抗體(11 000)進行檢測，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（15 000），用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的羊抗鼠抗血清（中杉金橋公司）和ECL試劑（Amersham）使結(jié)合

17、的抗體顯色。    VEGFR?3/Fc 與GST?VEGF?D的結(jié)合反應    分別以VEGFR?3/Fc(0.5 g/ml)和GST?VEGF?D(4g/ml)包被ELISA板，4過夜,PBS洗后用含10 %小牛血清的PBS封閉。分別加入GST?VEGF?D和VEGFR?3/Fc孵育1小時, 用PBS Tween 20洗3遍后加入抗VEGF?D和VEGFR?3/Fc的單克隆抗體, 孵育1小時, 用PBS Tween 20洗滌, 加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗, BCIP/NBT顯色液顯色,OD405n

18、m檢測。    MTT實驗    HEL細胞按照1×105 /ml的濃度接種于96孔板,100l/well，分別加入不同濃度的GST、GST?VEGF?D, 100l/well(每個濃度3個平行孔), 在37、5% CO2孵箱培養(yǎng)72小時后，每孔加MTT溶液20 l，37孵育4小時后加入二甲基亞砜溶解沉淀，測OD492 nm值，用SAS 8.0作兩因素的析因設計的方差分析。    雞胚尿囊膜實驗    將購自中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧

19、研究所的受精卵雞蛋于39孵育3天，無菌條件下加入不同劑量（5、10、20 g/ml）的可溶性的GST?VEGF?D蛋白，以GST為對照，用蓋玻片蓋住，石蠟封口，繼續(xù)在38孵化3天后打開，拍照。用CMIAS?圖像分析軟件進行血管計數(shù)并計算血管面密度NA（V）。用SAS 8.0作單因素多水平方差分析。    統(tǒng)計學處理    采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件分析處理。    結(jié)    果    VEGF?D

20、片段的擴增    從人胎肺組織中提取總RNA，經(jīng)RT?PCR反轉(zhuǎn)為cDNA。通過PCR法擴增目的片段后經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，條帶介于250和500之間，與理論推測值351 bp相符（見圖1）。    Figure 1. Electrophoresis pattern of RT?PCR of VEGF?D mature fragment on agarose gel. Lane 1: DNA marker. Lane 2: VEGF?D PCR product.重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定  &#

21、160; PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接連接到pGEM?T載體上，構(gòu)建pGEM?T/VEGF?D重組質(zhì)粒，基因測序正確后用Not和EcoR 雙酶切連接到pGEX?5X?1上構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX?5X?1/VEGF?D。 利用EcoR 和Not進行重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定（如圖2）。重組質(zhì)粒插入片段大小約為351 bp，證明pGEX?5X?1/VEGF?D構(gòu)建正確。    融合蛋白在大腸桿菌中的表達與純化    GST和VEGF?D的VHD片段的蛋白分子量分別為26 kD和12 kD，GST?VEGF?D的分子量理

22、論值應為38 kD。SDS?PAGE分析含pGEX?5X?1/VEGF?D的大腸桿菌BL21（DE3）的蛋白表明，融合蛋白分子量與預期結(jié)果一致，為38 kD左右。表達產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在（圖3）。    Figure 3. Expression and identification of GST?VEGF?D fusion by SDS PAGE.Lane 1: protein mole?cular weight standard. Lane 2: E.coli BL21 control. Lane 3: GST control. Lane 4:

23、supernatant of GST?VEGF?D. Lane 5: precipitation of GST?VEGF?D.    以牛血清白蛋白為標準蛋白，將電泳后凝膠中經(jīng)考馬斯亮藍染色得到的蛋白帶用GelPro軟件分析，GST?VEGF?D融合蛋白占細菌總蛋白的15 %。    對超聲后的細菌蛋白用含1% Triton X?100的PBS溶解之后，經(jīng)GST?親合層析柱純化，然后收集洗脫組分，再經(jīng)透析除去谷胱甘肽。SDS?PAGE檢測蛋白的純度，結(jié)果如圖4所示。可見在純化的組分中含有部分融合蛋白降解后形成的GS

24、T。    Figure 4. Identification of purified GST?VEGF?D by SDS PAGE.Lane 1: protein molecular weight stan?dard. Lane 2. GST control. Lane 3: supernatant of GST?VEGF?D. Lane 4: purified recombinant protein of GST?VEGF?D.    融合蛋白的Western blot分析   &#

25、160;分別用抗GST抗體和抗VEGF?D單克隆抗體為一抗對融合蛋白進行 Western blot分析，結(jié)果在38 kD都呈現(xiàn)特異性的條帶（圖5）。    Figure 5. Analysis of recombinant GST?VEGF?D by Westen blot.Lane 1 and 3: GST control. Lane 2 and 4: GST?VEGF?D fusion protein.    GST?VEGF?D與VEGFR?3/Fc的結(jié)合活性分析    

26、;將濃度為1、2 g/ml的VEGFR?3/Fc與20 g/ml的GST?VEGF?D混合，以VEGFR?3/Fc純品為對照，通過檢測450 nm處的OD值分析GST?VEGF?D與VEGFR?3/Fc的結(jié)合活性，結(jié)果如圖6所示，表明重組人GST?VEGF?D可與VEGFR?3/Fc相互作用。    Figure 6. In vitro characterization of GST?VEGF?D and VEGFR?3/Fc. GST?VEGF?D fusion protein is able to interact with VEGFR?3/Fc.

27、Results are shown as the ±SD of three wells.    GST?VEGF?D促進HEL細胞增殖    以GST為對照，檢測GST?VEGF?D對HEL細胞生長的影響，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，與GST對照組相比，GST?VEGF?D融合蛋白可顯著刺激HEL細胞的增殖（F=17.01，P<0.0003）,隨著GST?VEGF?D濃度的升高，HEL細胞量也隨之增加(F=6.59,P<0.0002)，而隨著GST濃度的升高，HEL細胞數(shù)量并沒有明顯變化(F=1

28、.07,P>0.05)。這些結(jié)果說明GST?VEGF?D融合蛋白在一定濃度范圍內(nèi)可以刺激HEL細胞的生長。    Figure 7. Stimulation of HEL cells proliferation with GST?VEGF?D.Results are shown as the ±SD of three wells. *P<0.01, compared wtih GST.    GST?VEGF?D對雞胚尿囊膜血管的影響    雞胚尿囊膜血

29、管生成模型已經(jīng)被廣泛地應用在促進血管生成和抗血管生成分子的研究中。在我們的實驗中，隨著GST?VEGF?D劑量的升高，雞胚尿囊膜毛細血管的數(shù)量也隨著增加(F=3.34,P<0.0425)，當GST?VEGF?D達到20 g時，尿囊膜血管可形成立體的致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而對照組沒有明顯的變化（圖8）。 2.討    論    VEGF?D基因編碼53 kD的前體形式的VEGF?D，經(jīng)過細胞內(nèi)或細胞外蛋白酶的加工，去掉N?末端和C?末端的多肽成為只含VEGF同源區(qū)（VHD）片段的成熟形式的VEGF?D。與未經(jīng)加工的V

30、EGF?D相比，經(jīng)過加工的VEGF?D結(jié)合VEGFR?2和VEGFR?3的能力分別提高了290倍和40倍，因此具有最高的結(jié)合活性6。本研究從人胎肺中直接克隆VEGF?D的VHD片段，構(gòu)建重組表達載體并在大腸桿菌中成功表達融合蛋白GST?VEGF?D。ELISA和MTT實驗表明，融合蛋白GST?VEGF?D能與重組人VEGFR?3結(jié)合，刺激HEL細胞生長，說明本實驗所表達的成熟形式的VEGF?D蛋白具有生物學活性，與報道相一致7。報道中成熟的VEGF?D的分子量為21 kD的非共價結(jié)合的二聚體，而本實驗中目的蛋白的分子量為12 kD的單體也具有相應的活性。   &#

31、160;雞胚尿囊膜是雞胚外的一層膜，主要功能是提供進行氣體交換的表面，同時雞胚尿囊膜功能的行使也依賴于致密的血管網(wǎng)的支撐。正是由于雞胚發(fā)育過程中大量尿囊膜血管的形成，為研究血管發(fā)生和形成提供了很好的模型7。    VEGF?D與VEGFR?3結(jié)合促進胚胎期淋巴管增生和形成，而且在腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。VEGF?D還可以與VEGFR?2作用，刺激血管的形成。在本實驗中，成熟形式的VEGF?D能夠促進尿囊膜血管的形成，使之形成毛細血管網(wǎng)，這里VEGF?D與VEGFR?2的結(jié)合可能發(fā)揮了主要作用。因為未經(jīng)過加工的VEGF?D前肽只與VEGFR?3結(jié)合，而成熟形式的VEGF?D與VEGFR?2和VEGFR?3的結(jié)合能力都升高，但與VEGFR?2的親和能力的提高是與VEGFR?3能力提高的倍，而VEGFR?2主要介導血管的形成6，因此有理由認為雞胚尿囊膜血管的大量形成歸功VEGF?D與VEGFR?2的結(jié)合而介導的信號通路。    總之，本研究利用大腸桿菌系統(tǒng)成功表達重組GST?VEGF?D融合蛋白，GS