1、1第三章第三章 雙向電泳技雙向電泳技術(shù)和實(shí)驗(yàn)流程術(shù)和實(shí)驗(yàn)流程2*1809年俄國物理學(xué)家Pece首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。*1909年Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動(dòng)稱為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測定了轉(zhuǎn)化酶和過氧化氫酶的電泳移動(dòng)和等電點(diǎn)。*1937年瑞典Uppsala大學(xué)的Tiselius對電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及、球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開拓性貢獻(xiàn)而獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。*1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，

2、對氨基酸的分離進(jìn)行過研究。*從上世紀(jì)50年代起，特別是1950年Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。*1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時(shí)代。 *由80年代發(fā)展起來的新的毛細(xì)管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視。*雙向電泳由OFarrells于1975年首次建立并成功地分離約1000個(gè)E.coli蛋白。 3一、電泳的基本原理一、電泳的

3、基本原理1、在電場作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis)。 由F = Eq，f = 6r 可得=Eq/(6r ) 2、帶電顆粒的泳動(dòng)速度同電場強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷量成正比，與顆粒半徑和介質(zhì)黏度成反比。 蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)。其泳動(dòng)速度取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量以及顆粒的大小和形狀。第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)電泳的基本原理蛋白質(zhì)電泳的基本原理4 在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷(種類和數(shù)量)、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們在相同電場中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分

4、離、分析和鑒定的基本原理。5二、影響電泳速度的因素二、影響電泳速度的因素 1、電場強(qiáng)度；2、緩沖溶液的pH；3、緩沖溶液的離子強(qiáng)度；4、電滲；5、焦耳熱三、電泳的分類三、電泳的分類 按原理分類：自由界面電泳：又稱移動(dòng)界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。穩(wěn)態(tài)電泳（或稱置換電泳）：分子顆粒的電泳遷移在一定時(shí)間達(dá)到一個(gè)穩(wěn)態(tài)后，帶的寬度不隨時(shí)間而變化。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的

5、差異，又可分為不同的類型。67按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。8淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時(shí)間長，操作麻煩，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用。瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。

6、瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。 聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。9 另外根據(jù)支持介質(zhì)形狀不同，區(qū)帶電泳可分為：薄層電泳、板電泳、柱電泳。 根據(jù)用途不同，可分為：分析電泳、制備電泳、定量電泳、免疫電泳。 按pH的連續(xù)性不同，可分為：連續(xù)pH電泳，不連續(xù)pH電泳。 10四、聚丙烯酰胺凝膠電泳四、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegel polyacrylamidegel electrophoresiselectrophoresis，簡稱PAGEPAGE

7、）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。PAGEPAGE應(yīng)用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定分子量、等電點(diǎn)等。111、丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn)：幾乎無電滲作用。化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)。對pHpH和溫度變化較穩(wěn)定。在一定濃度范圍內(nèi)凝膠無色透明，有彈性，機(jī)械性能好，易觀察。凝膠孔徑可調(diào)。分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率。122、聚丙烯酰胺凝膠的聚合13催化劑和加速劑的種類AP-TEMEDAP-TEMED：化學(xué)聚合作用。加速劑四甲基乙二胺(TEMED)的堿基可使催化劑過硫酸銨( (簡稱A

8、P)AP)的水溶液產(chǎn)生出游離氧原子，然后激活A(yù)crAcr單體，形成單體長鏈，在交聯(lián)劑BisBis作用下聚合成網(wǎng)狀的凝膠。核黃素-TEMED-TEMED：光聚合作用。光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能發(fā)生，因?yàn)楹它S素在TEMEDTEMED及光照條件下，還原成無色核黃素，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。1415丙烯酰胺會產(chǎn)生如下幾個(gè)化學(xué)反應(yīng)：高濃度酸和堿會促進(jìn)其水解形成丙烯酸和NH3NH3。與一些羥基化合物如酚或酯族醇反應(yīng)，生成- -芳氧基或烷氧基丙酰胺。在2020能NH3NH3反應(yīng)，生成、- -氮川三丙酰胺。與一些硫醇反應(yīng)，生成- -烷基丙酰胺。也會由于超聲、- -射線和自然光線引起

9、聚合作用。如果烴鍵靠近在高度聚合的位置，酰胺基也會受到分子間的縮聚作用而成亞胺橋。16凝膠的孔徑可調(diào)性及其他性質(zhì)每100100亳升凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，用T%T%表示； T% = (a+b)/mT% = (a+b)/ma a：丙烯酰胺克數(shù)；b b：N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺克數(shù)；m m：緩沖液體積( (毫升) )。3、聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑：1718濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)19聚丙烯酰胺凝膠電泳的異常現(xiàn)象及解決辦法1.1.凝膠未聚合2.2.未加水層時(shí)凝膠聚合3.3.電泳后未能檢測出樣品4.4.樣品分離區(qū)帶寬或拖尾5.5.只顯一條區(qū)帶6.6.分離區(qū)帶呈條紋狀20第二節(jié)第二節(jié)

10、 蛋白質(zhì)等電聚焦電泳蛋白質(zhì)等電聚焦電泳 1966年，瑞典科學(xué)家Rible和Vesterberg建立。等電聚焦：isoelectric focusing,IEF。1.1.電泳系統(tǒng)中加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體，當(dāng)通直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)載體即形成一個(gè)由陽極到陰極連續(xù)增高的pHpH梯度。蛋白進(jìn)入時(shí)，不同的蛋白移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒HpH位置上，從而使不同等電點(diǎn)的蛋白得以分離。2.2.優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測定蛋白或多肽的等電點(diǎn)。3.3.缺點(diǎn)：需無鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白。21 利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子等電點(diǎn)的不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的（或非

11、線性）pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。分析對象只限于蛋白質(zhì)和其他兩性分子。 根據(jù)建立pH梯度原理不同，可分為載體兩性電解質(zhì)pH梯度（carrier ampholyte pH gradient)和固相pH梯度(immobilized pH gradient, IPG)。22一、基本原理一、基本原理1、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：取決于其氨基酸的組成。 組成每一種蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸的數(shù)目和比例是不同的，故蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)范圍很寬，這使得可以利用它來分離和分析蛋白質(zhì)。 232、聚焦效應(yīng)3、等電聚焦的分辨率24二、載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦電泳1、載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的條件o在等電點(diǎn)處有足夠的緩沖能力，以便

12、能控制pH梯度，而不致被樣品的緩沖能力而改變pH梯度。o在等電點(diǎn)處有足夠高的電導(dǎo)，以便使一定的電流通過，具備不同pH的載體有相同的電導(dǎo)系數(shù)，是整個(gè)體系中的電導(dǎo)均勻。o分子質(zhì)量小，便于與被分離的高分子物質(zhì)分離。o化學(xué)組成不同于被分離物質(zhì)，不干擾測定。o應(yīng)不與分離物質(zhì)反應(yīng)或使之變性。 由多乙烯多胺與丙烯酸加成制備( (有不同pHpH范圍的商品兩性電解質(zhì)載體) )252、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的形成有兩種方法產(chǎn)生pH梯度：用兩種不同的pH的緩沖液互相擴(kuò)散，在混合區(qū)形成pH梯度。這種方法形成的pH梯度很不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不使用。人工pH梯度。利用載體兩性電解質(zhì)在電場作用下自然形成pH梯度，常用該方

13、法。天然pH梯度。263、載體兩性電解質(zhì)分離原理等電聚焦樣品可放于任何位置。4、載體兩性電解質(zhì)的缺點(diǎn)o載體兩性電解質(zhì)合成過程復(fù)雜，影響蛋白質(zhì)點(diǎn)的位置，從而影響了重復(fù)性；o負(fù)極漂移現(xiàn)象，使pH梯度不穩(wěn)定；o負(fù)極漂移現(xiàn)象使堿性蛋白質(zhì)無法聚焦；o凝膠灌制重復(fù)性差，凝膠機(jī)械穩(wěn)定性差，影響重復(fù)性。5、等電聚焦中應(yīng)注意的事項(xiàng)opH梯度的選擇；o添加中性載體兩性電解質(zhì)；o電流降到最小切恒定時(shí)盡快結(jié)束IEF;opH梯度測定：電泳結(jié)束后，用微電機(jī)檢測凝膠表面pH;o蛋白質(zhì)在pI處形成沉淀。添加表面活性劑。27三、固相pH梯度等電聚焦電泳技術(shù) 固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術(shù)。固相pH梯度

14、等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達(dá)到0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方法之一。281、固相pH梯度的介質(zhì) 其所用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，它們與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有相似的聚合行為。292、固相pH梯度的建立 固相pH梯度等電聚焦技術(shù)的突破要?dú)w功于Immobilines試劑（Amersham Pharmacia Biotech, APB）的基礎(chǔ)上開發(fā)的固相pH梯度（IPG）技術(shù)。Immobilines（固相試劑）是一系列性質(zhì)穩(wěn)定的具有弱酸弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有類的聚合行為。每個(gè)分子都有一個(gè)單一的酸性

15、或堿性緩沖基團(tuán)與丙烯酰胺單連，其結(jié)構(gòu)式為： 其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的雙鍵可以在聚合過程中共價(jià)鍵合鑲嵌到聚丙烯酰胺介質(zhì)中。所以它是固相的，即使是在電場中也不會漂移。分子另一端的R基團(tuán)為弱酸或弱堿性的緩沖基團(tuán)，利用緩沖體系滴定終點(diǎn)附近一段pH范圍就可形成近似線性的分布在pH310范圍的緩沖體系。 所以固相pH梯度與載體兩性電解質(zhì)pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時(shí)候便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點(diǎn)后才形成pH梯度。30固相固相pHpH梯度聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)結(jié)合緩沖基團(tuán)梯度聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)結(jié)合緩沖基團(tuán) 314、固

16、相pH梯度的優(yōu)點(diǎn)和注意事項(xiàng)3、固相pH梯度等電聚焦原理 蛋白質(zhì)分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中遷移，知道達(dá)到自己的等電點(diǎn)，停止遷移。 固相pH梯度可窄至pH0.1的范圍，因此分辨率極高，可達(dá)0.001pH；pH梯度穩(wěn)定，不漂移；靈活性大，可隨意選擇pH梯度和斜率；重復(fù)性好；加樣容量大；樣品中鹽的干擾小；對堿性蛋白質(zhì)也能很好的分離，無邊緣效應(yīng)，故可用很窄的膠條（如5mm寬）聚焦，特別適合于雙向電泳的第一相，但固相 pH梯度灌膠技術(shù)復(fù)雜，只能使用聚丙烯酰胺凝膠，電泳時(shí)候需要高電壓，電泳時(shí)間長，窄范圍pH測定困難，只能計(jì)算。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)：溫度：20-30 ；電壓：梯度上升。32加樣方式 3

17、3等等電電聚聚焦焦電電泳泳進(jìn)進(jìn)行行過過程程中中等等電電聚聚焦焦電電泳泳結(jié)結(jié)束束后后（）（）（）（）高高pH高高pH低低pH低低pH34第三節(jié) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳一、常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳1、基本原理:天然狀態(tài)生物大分子聚丙烯酰胺凝膠電泳（native PAGE）,在恒定的、非解離的緩沖系統(tǒng)中分離蛋白質(zhì)。可得到天然蛋白質(zhì)的分子量。35連續(xù)電泳不連續(xù)電泳濃縮效應(yīng)凝膠層緩沖液離子成分pH電位梯度濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)362、影響凝膠聚合的因素 形成凝膠試劑的純度 凝膠濃度 溫度和氧氣的影響：23-253、聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)37二、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1、基本原理o 聚丙烯酰胺

18、凝膠系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉(sodium (sodium dodecylsulphate)SDSdodecylsulphate)SDS，蛋白電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無關(guān)。o 加入SDSSDS和巰基乙醇后，巰基乙醇使蛋白的二硫鍵還原，SDSSDS使氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到P P分子上，形成蛋白- -SDSSDS，帶上相同密度負(fù)電荷，形狀為長橢圓形，短軸一定，長軸長度正比于蛋白分子量。o 分離測定：o 測分子量( (與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較) )o 鑒定樣品純度( (條帶數(shù)目) )o 測定樣品蛋白含量：掃描定量( (比色) ) 382、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類3、SDS-聚丙

19、烯酰胺凝膠電泳的影響因素 溶液中SDS單體的濃度 二硫鍵是否完全還原 緩沖系統(tǒng)的選擇凝膠濃度的選擇39凝膠電泳的操作要點(diǎn)1.1.凝膠制備2.2.電極緩沖液3.3.樣品處理及加樣4.4.電泳5.5.染色與固定6.6.脫色7.7.分析40？pH值不對=41第四節(jié) 雙向電泳一、基本原理 IEF-SDS-PAGE42o非變性2D-PAGE：兩向均在非變性條件下進(jìn)行，這樣分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和表觀分子量同生理?xiàng)l件下獲得的這些蛋白的值是一樣的；o非變性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非變性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的條件下進(jìn)行。適于分析非共價(jià)鍵連接的蛋白蛋白間的相互作用

20、。o非變性/還原/SDS-2D-PAGE：非變性條件下IEF聚焦，之后用8M尿素5%-ME2%SDS進(jìn)行平衡，再進(jìn)行第二向SDS-PAG電泳。此時(shí)分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)可進(jìn)行點(diǎn)的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鑒定，提供關(guān)于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息。o變性2D-PAGE：樣品先用2%SDS5%-ME95變性5min，IEF在8M尿素1%NP-40條件下進(jìn)行，之后膠條用2%SDS5%-ME平衡，然后進(jìn)行SDS-PAGE。該技術(shù)適于DNA序列和多肽結(jié)構(gòu)的分析，或分析被碳?xì)滏I連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性，但此方式顯示的大于100Kd的蛋白質(zhì)點(diǎn)少于第三種方式雙向電泳的分類雙向電

21、泳的分類43二、流程（一）樣品制備（二）第一向：等電聚焦 1、加樣 2、運(yùn)行（三）膠條的平衡（四）第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（五）膠上蛋白的檢測 1、考馬斯亮藍(lán)染色 2、銀染 3、負(fù)染 4、熒光染色44（六）雙向電泳凝膠的檢測 1、目測 2、自動(dòng)化檢測 3、雙向電泳的數(shù)據(jù)庫（七）雙向凝膠電泳技術(shù)當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)： 1、低拷貝蛋白的檢測受限； 2、極酸或極堿蛋白的分離較難； 3、分子質(zhì)量極大或極小蛋白的分離較難； 4、難溶蛋白的檢測較困難； 5、得到高質(zhì)量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術(shù)45一維固相一維固相pH梯度等電聚焦（梯度等電聚焦（IEF with IPG）：）： o IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在pH310不同值的緩沖體系。根