1、青蒿素增敏復方抑制腫瘤細胞增殖及延緩荷瘤裸鼠移植腫瘤生長的研    【摘要】  【目的】提高青蒿素抗腫瘤效率，闡明青蒿素增敏復方的抑瘤增敏機理。【方法】采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定各藥物對人肝癌細胞株HepG2細胞的生長抑制率;經(jīng)皮下接種HepG2細胞進行荷瘤裸鼠造模，測定給藥15 d后瘤體質(zhì)量，計算抑瘤率。【結(jié)果】青蒿琥酯配伍馬來酸二乙酯、巰基琥珀酸和氨基三唑后，腫瘤細胞的生長抑制率較相同濃度的青蒿琥酯單方高4384%，抑瘤率較青蒿琥酯單方提高近3倍。HepG2細胞中抗氧化劑含量及抗氧化酶活性測定結(jié)果表明，空白組的測定值均高于單方組和復

2、方組，而復方組的測定值低于單方組。【結(jié)論】青蒿素增敏復方可能通過降低抗氧化劑含量及抑制抗氧化酶活性發(fā)揮抗腫瘤增敏作用。 【關(guān)鍵詞】  青蒿素/藥理學;腫瘤/中西結(jié)合療法;增敏;細胞培養(yǎng);疾病模型，動物;裸鼠 青蒿素是從中藥青蒿(Artemisia annua L.)中提取的抗瘧倍半萜過氧化內(nèi)酯，其人工半合成衍生物青蒿琥酯、雙氫青蒿素、蒿甲醚等已廣泛用于瘧疾治療。在青蒿素抗瘧研究中發(fā)現(xiàn)，阿霉素、維生素B2和甲萘酯等自由基引發(fā)劑(促氧化劑)與青蒿素有協(xié)同抗瘧作用，而生育酚、抗壞血酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇等自由基清除劑(抗氧化劑)則能降低青蒿素的抗瘧作用1。當瘧原蟲的過

3、氧化物酶和過氧化氫酶受到抑制后，青蒿素的療效則明顯提高2。因此，自由基引發(fā)劑增加或自由基清除劑減少對青蒿素的抗瘧活性都有增效作用。 為提高青蒿素的抗腫瘤效果，本研究以谷胱甘肽(GSH)耗竭劑馬來酸二乙酯、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPX)抑制劑巰基琥珀酸、過氧化氫酶(CAT)抑制劑氨基三唑等自由基清除劑與青蒿琥酯組成抗腫瘤增敏復方，通過體外及體內(nèi)實驗比較復方與單方抑制人肝癌細胞株HepG2增殖及延緩荷瘤小鼠移植腫瘤生長的效果，并初步闡明青蒿琥酯增敏復方增強抗腫瘤效果的作用機制，為青蒿素抗腫瘤的臨床應用打下基礎(chǔ)。現(xiàn)報道如下。 1材料與方法 11藥物和試劑青蒿琥酯由桂林

4、南藥股份有限公司生產(chǎn)(批號：LA090902)，馬來酸二乙酯為東京化成工業(yè)公司產(chǎn)品，巰基琥珀酸為Alfa公司產(chǎn)品，氨基三唑為上海精純試劑有限公司產(chǎn)品，5氟尿嘧啶(5FU)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基(低糖)購自Gibco公司，胰酶、胎牛血清均購自TBD公司，蛋白質(zhì)、GSH含量及GSHPX、CAT活性測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)(批號：20090221)。 12實驗動物和腫瘤細胞株SPF級BALB/cnu裸鼠，雌性，4周齡，體質(zhì)量1618 g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK粵20060015。人肝

5、癌HepG2細胞株由中山大學提供。 13主要儀器CK40F200型倒置顯微鏡(Olympus公司)，HW0301TVBA型CO2培養(yǎng)箱(Harrls公司)，Legend Micro 17/17R 21/21R型高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技中國有限公司)，MK3型酶標儀(熱電上海儀器有限公司)，BS124S型電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)，722型可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。 14MTT比色測定3取對數(shù)生長期的HepG2細胞，用25 g/L胰酶消化為單個細胞，作細胞計數(shù)，以培養(yǎng)液稀釋為終濃度5×104/mL的單細胞懸液，每孔100 L接種

6、于96孔板中，置于37、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，待細胞貼壁后，加入100 L終濃度為10-710-2mol/L的藥物于各孔中保溫48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 L，置于37、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中保溫4 h，小心吸掉孔中培養(yǎng)液，加入150 L DMSO，靜置10 min后，用酶標儀測定490 nm處的光吸收值(D490)。 15GSH含量及GSHPX、CAT活性測定按試劑盒說明書操作。 16實驗動物分組按照隨機原則，將裸鼠分為5組：模型組，青蒿琥酯單方組(單方組)，青蒿琥酯+馬來酸二乙酯+巰基琥珀酸+氨基三唑復方1、2組(復方1、2組

7、)，陽性對照組(5FU組)，復方1、2組分別皮下(遠離腫瘤部位)、瘤下(接近腫瘤部位)注射，每組各5只。 17癌細胞接種造模4用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HepG2細胞，取對數(shù)生長期的培養(yǎng)細胞，以25 g/L胰酶消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，1 000 r/min離心5 min，收集細胞，用生理鹽水懸浮細胞，定容，取02 mL HepG2細胞(5×1066×106/mL)接種于裸鼠頸背部皮下。 18給藥方法接種10 d后成瘤體積約100 mm3時給藥，青蒿琥酯劑量為40 mg·kg-1·d-1，馬來酸二乙酯

8、劑量為200 mg·kg-1·d-1，巰基琥珀酸劑量為20 mg·kg-1·d-1，氨基三唑劑量為74 mg·kg-1·d-1，5FU劑量為185 mg·kg-1·d-15。皮下或瘤下注射量為10 L，連續(xù)用藥15 d。 19數(shù)據(jù)計算p生長抑制(%)=(1D實驗孔/D空白孔)×100%。p抑瘤(%)=(m瘤，模型組m瘤，治療組)/ m瘤， 模型組×100%。V腫瘤(mm3)=l腫瘤×h2腫瘤/2。 110統(tǒng)計學方法采用簡明統(tǒng)計軟件(CS2000)，版本號1034進行

9、統(tǒng)計學處理。 2結(jié)果 21青蒿琥酯及其復方組成藥物的細胞毒性測定將HepG2細胞經(jīng)不同藥物處理48 h后，采用MTT法測定各藥物的D490值，由此計算得其半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果顯示：青蒿琥酯的IC50=70×10-5mol/L，馬來酸二乙酯的IC50=20×10-5 mol/L ，巰基琥珀酸的IC50=21×10-4 mol/L ，氨基三唑的IC50=70×10-4 mol/L。由此可知，各藥物對HepG2細胞的毒性由高到低依次為馬來酸二乙酯>青蒿琥酯>巰基琥珀酸>氨基三唑。 22青蒿琥酯及其復方抗

10、腫瘤細胞增殖的體外評價根據(jù)各藥物對HepG2細胞的IC50進行青蒿琥酯復方配伍，其中青蒿琥酯濃度為5×10-5 mol/L ，馬來酸二乙酯濃度為05×10-5 mol/L ，巰基琥珀酸濃度為1×10-5 mol/L ，氨基三唑濃度為1×10-4 mol/L。采用MTT法測定單方及復方作用后的D490值，由此計算得其p生長抑制，結(jié)果見圖1。 圖1結(jié)果表明，青蒿琥酯復方對HepG2細胞的生長抑制作用顯著高于青蒿琥酯單方，2組生長抑制率比較差異有顯著性意義(P<001)。 23自由基清除劑對青蒿琥酯抗腫瘤的增敏作用機理為了揭示青蒿琥酯

11、復方的增敏機理，在HepG2細胞被藥物分別作用24 h和48 h后，檢測空白組、單方組和復方組中的GSH含量及GSHPX、CAT活性。 圖2結(jié)果顯示，經(jīng)青蒿琥酯復方處理后，HepG2細胞中的GSH含量及GSHPX、CAT活性均較單方組有所降低，其中GSHPX在藥物作用24 h后的活性與空白組比較差異有顯著性意義(P<005)，CAT在藥物作用24 h及48 h后的活性與空白組比較差異均有顯著性意義(P<005)。 24青蒿琥酯及其復方抑制荷瘤裸鼠移植腫瘤生長的體內(nèi)評價用藥前先測定瘤體積，用藥后剝?nèi)∧[瘤，稱量瘤體質(zhì)量，測定瘤體積;根據(jù)用藥后瘤體質(zhì)量，計算單方組、復方組和5F

12、U組的抑瘤率(%)，結(jié)果見表1。荷瘤裸鼠用藥后的腫瘤形態(tài)見圖3(彩圖見第318頁)。a. GSH含量b. CAT活性c. GSHPX活性表1青蒿琥酯及其復方對荷瘤裸鼠移植腫瘤生長的抑制作用 表1結(jié)果顯示：用藥后，復方1、2組及5FU組均可不同程度抑制腫瘤生長，其中復方2組與5FU組荷瘤體積顯著降低，抑瘤率升高，與模型組比較差異有顯著性意義(P<005或P<001)，表明瘤下注射復方抑瘤作用優(yōu)于皮下注射。 由表1和圖3可知，青蒿琥酯增敏復方的抑瘤作用高于青蒿琥酯單方，表明自由基清除劑在活體條件下仍有助于青蒿琥酯發(fā)揮其抗腫瘤作用。不過，按現(xiàn)有藥物濃度，青蒿琥酯復方的

13、抑瘤效果仍低于5FU，有待進一步從給藥方式、劑量、配伍等方面加以改進。 3討論 早在2000年，陳征途等6和吳玲霓等7就利用MTT染色、DNA梯度電泳、流式細胞儀和透射電鏡等多種分析手段證明，誘導細胞凋亡是青蒿琥酯體外抑制HepG2細胞增殖的機理之一。青蒿素類藥物對鐵離子化合物(如血紅素)的高度親和性賦予其更強的凋亡誘導活性。Lai等8發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素對人淋巴細胞白血病細胞的殺傷作用比對正常人淋巴細胞的殺傷力大100倍，推測可能是癌細胞的含鐵量高于正常細胞所致。鄭青等9也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)鐵蛋白對青蒿琥酯殺傷人肺癌細胞株A549具有增效作用，表明轉(zhuǎn)鐵蛋白富集的鐵離子促進了青蒿琥酯羧自

14、由基形成。 青蒿素類藥物主要以羧自由基誘導細胞凋亡，因而易被GSH及其他非蛋白質(zhì)巰基所破壞10。同時，青蒿素類藥物可誘導腫瘤細胞中抗氧化酶基因表達，從而抵消青蒿素羧自由基對腫瘤的殺傷作用11。放射治療增敏劑丁胱亞磺酰亞胺(BSO)是最常用的GSH抑制劑，它通過抑制谷胱甘肽合成酶阻斷GSH生成12。馬來酸二乙酯(又名順丁烯二酸二乙酯)和N乙基馬來酰亞胺(又名N乙基順丁烯二酰亞胺)也能在短期內(nèi)使細胞內(nèi)GSH耗竭。巰基琥珀酸(又名硫代蘋果酸)和氨基三唑分別為GSHPX和CAT抑制劑，可降低細胞中的GSHPX和CAT活性。馬來酸二乙酯只會使GSH在短時間內(nèi)耗竭，停藥后GSH含量即可回升，因此

15、其毒性很低。巰基琥珀酸和氨基三唑只抑制抗氧化酶的活性，而不抑制其合成，因此其毒性也低。 本研究通過青蒿琥酯增敏復方的體外評價，初步證明復方中的3種促氧化劑(抗氧化酶抑制劑)能不同程度地降低GSH含量及GSHPX、CAT活性，而這些自由基引發(fā)效應與增敏復方對HepG2細胞較高的生長抑制率呈正相關(guān)。同時，體內(nèi)實驗結(jié)果也表明，增敏復方的抑瘤率較單方明顯提高，表明這些增敏劑在活體腫瘤模型中也能很好地發(fā)揮增敏作用，初步驗證了青蒿琥酯增敏復方優(yōu)于青蒿琥酯單方的消瘤效果。雖然目前該復方的抗瘤作用還不及常規(guī)抗腫瘤藥物，但若進一步優(yōu)化使用劑量和給藥方式，未來將有可能發(fā)展成為新一代臨床腫瘤化療復方藥物。

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