1、1 / 59 文檔可自由編輯打印ICS備案號(hào)：中華人民共和國(guó)海洋行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HYHY/T 海洋災(zāi)害調(diào)查技術(shù)規(guī)程 海洋災(zāi)害調(diào)查規(guī)范 第 3 部分：海洋生態(tài)災(zāi)害調(diào)查（征求意見稿）-發(fā)布-實(shí)施國(guó)國(guó)家家海海洋洋局局 發(fā)發(fā)布布文檔可自由編輯打印目 次目 次.I前 言.IV1 范圍.152 規(guī)范性引用文件.153 術(shù)語和定義.124 小型浮游生物的測(cè)定顯微鏡個(gè)體計(jì)數(shù)法.34.1 技術(shù)要求.34.2 調(diào)查要素.44.3 采樣.44.4 樣品分析.564.5 資料整理.64.6 填寫統(tǒng)計(jì)表.74.7 繪制分布圖.75 赤潮甲藻孢囊檢測(cè)光鏡法.75.1 調(diào)查內(nèi)容.75.2 調(diào)查方法.75.3 樣品采集.786 赤潮

2、毒素檢測(cè).96.1 麻痹貝毒的檢驗(yàn)ELISA 法 .96.2 腹瀉性貝毒的檢驗(yàn)ELISA 法 .116.3 神經(jīng)性貝毒的檢驗(yàn)ELISA 法 .146.4 記憶缺失性貝毒的檢驗(yàn)ELISA 法 .167 弧菌總數(shù)的測(cè)定-平板計(jì)數(shù)法.187.1 原理.187.2 試劑和培養(yǎng)基的配制.187.3 儀器設(shè)備.197.4 樣品采集。.197.5 測(cè)定步驟.207.6 記錄與計(jì)算.22217.7 注意事項(xiàng).22218 腸球菌的測(cè)定MPN 法.228.1 原理.228.2 儀器設(shè)備.228.3 樣品采集.228.4 培養(yǎng)基及稀釋液.228.5 檢測(cè)步驟.238.6 結(jié)果表征.248.7 檢測(cè)報(bào)告.259 海水

3、中甲肝病毒的檢驗(yàn)-PCR 法.259.1 原理.25II / 59 文檔可自由編輯打印9.2 試劑配制.259.3 儀器設(shè)備.26259.4 樣品采集及處理.269.5 RNA 提取 .269.6 引物的設(shè)計(jì).269.7 反轉(zhuǎn)錄.269.8 PCR 擴(kuò)增 .269.9 結(jié)果判定.269.10 記錄.2610 海水中諾如病毒的檢驗(yàn)-PCR 法.272610.1 原理.272610.2 試劑配制.272610.3 儀器設(shè)備.2710.4 樣品采集及處理.2710.5 RNA 提取 .2710.6 引物的設(shè)計(jì).2710.7 反轉(zhuǎn)錄.282710.8 PCR 擴(kuò)增 .2810.9 結(jié)果判定.2810.

4、10 記錄.2811 魚類虹彩病毒的檢驗(yàn)PCR 法 .2811.1 方法原理.2811.2 試劑及其配制.2811.3 儀器及設(shè)備.2811.4 分析步驟.2812 海洋貝類體內(nèi)帕金蟲檢驗(yàn)-雷氏液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測(cè).292812.1 方法原理.292812.2 主要試劑和培養(yǎng)基的配制.2912.3 主要器材.2912.4 檢測(cè)流程.2912.5 PCR 檢測(cè) .302912.6 帕金蟲具體種類的測(cè)定.3113 海洋貝類體內(nèi)單孢子蟲檢驗(yàn).3213.1 方法原理.3213.2 主要試劑及其配制.3213.3 主要儀器及耗材.333213.4 檢測(cè)流程.333214 蝦類桃拉病毒的檢驗(yàn)PCR

5、 法 .3414.1 方法原理.3414.2 試劑及其配制.3414.3 儀器及設(shè)備.3414.4 試驗(yàn)方法.3414.5 結(jié)果判定.3514.6 記錄.3515 蝦類白斑病毒的檢驗(yàn)PCR 法 .35III / 59 文檔可自由編輯打印15.1 方法原理.3515.2 試劑及其配制.3515.3 儀器設(shè)備.3615.4 試驗(yàn)方法.3615.5 結(jié)果判定.3715.6 記錄.37附錄 A（規(guī)范性附錄）小型浮游生物海上采樣記錄表 .38附錄 B（規(guī)范性附錄）甲藻孢囊數(shù)量計(jì)數(shù)記錄表 .45405附錄 C（規(guī)范性附錄）弧菌平板計(jì)數(shù)記錄表 .46416附錄 D（規(guī)范性附錄）甲肝病毒記錄表 .47427附

6、錄 E（規(guī)范性附錄）諾如病毒記錄表.48438附錄 F（規(guī)范性附錄）魚類虹彩病毒檢測(cè)記錄.49449附錄 G（規(guī)范性附錄）單孢子蟲檢測(cè)實(shí)驗(yàn)記錄表.504550附錄 H（規(guī)范性附錄）蝦類桃拉病毒檢測(cè)記錄表.524752附錄 I（規(guī)范性附錄）蝦類白斑病毒檢測(cè)記錄表.534853前 言IV / 59 文檔可自由編輯打印HY/T海洋災(zāi)害調(diào)查技術(shù)規(guī)程分為四個(gè)部分：第 1 部分：海洋環(huán)境災(zāi)害調(diào)查；第 2 部分：海岸帶地質(zhì)災(zāi)害調(diào)查；第 3 部分：海洋生態(tài)災(zāi)害調(diào)查；第 4 部分：濱海濕地退化和人為災(zāi)害調(diào)查。本部分為 HY/T的第 3 部分。本部分的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D、附錄E、附錄F、附錄G、附錄H

7、、附錄I為規(guī)范性附錄。本部分由國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心提出。本部分由全國(guó)海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC283）歸口。本部分起草單位：國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心。本部分主要起草人：5 / 59 文檔可自由編輯打印海洋災(zāi)害調(diào)查技術(shù)規(guī)程 第 3 部分：海洋生態(tài)災(zāi)害調(diào)查1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了海洋赤潮、病原生物和外來海洋生物調(diào)查的一般規(guī)定、技術(shù)要求和調(diào)查（測(cè)定）要素，以及樣品采集、分析與資料整理的基本要求和方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于海洋災(zāi)害調(diào)查工作中的赤潮、病原生物和外來海洋生物的調(diào)查。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版

8、均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB3097 海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB18421-2001 海洋生物質(zhì)量GB12763.2-1991 海洋調(diào)查規(guī)范 第2部分：水文觀測(cè)GB12763.3-1991 海洋調(diào)查規(guī)范 第3部分：氣象觀測(cè)GB12763.6-1991 海洋調(diào)查規(guī)范 第6部分：生物調(diào)查GB17378.1-1998 海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第1部分：總則GB17378.2-1998 海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第2部分：數(shù)據(jù)處理與分析質(zhì)量控制GB17378.3-1998 海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第3部分：樣品采集、貯存與運(yùn)輸GB17

9、378.4-1998 海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第 4 部分：海水分析GB17378.5-1998 海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第 5 部分：沉積物分析GB17378.6-1998 海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第 6 部分：生物體分析GB17378.7-1998 海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第7 部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物調(diào)查ISO 3951：1989 取樣步驟和站位布設(shè)ISO 5667-1：1980 水質(zhì)取樣第一部分：取樣方法設(shè)計(jì)手冊(cè)ISO 5667-2：1991 水質(zhì)取樣第二部分：取樣技術(shù)手冊(cè)ISO 5667-3：1994 水質(zhì)取樣第三部分：樣品的保存與處理手冊(cè)ISO 8199：1988 水質(zhì)微生物培養(yǎng)物的計(jì)數(shù)指南ISO/IEC導(dǎo)則2：19

10、96 標(biāo)準(zhǔn)化和相關(guān)活動(dòng)一般詞匯HY/T 069-2005 赤潮監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程ISO 7899-1 Water quality - Detection and enumeration of intestinal enterococci in surface and waste water Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) by inocuLation in liquid medium.OIE(Office International des epizooties): Manual of Diagnostic Tests for A

11、quatic Animals 2003.Centre for Research on Introduced marine pests: Revised Protocols for Baseline Port Surveys for Introduced marine speciesSurvey design,Sampling protocols and Specimen handling 2001 3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。6 / 59 文檔可自由編輯打印3.1浮游生物 plankton是指缺乏發(fā)達(dá)的運(yùn)動(dòng)器官，沒有或只有微弱的運(yùn)動(dòng)能力，懸浮在水層中，常隨水流移動(dòng)的生物群。3.2

12、 赤潮毒素 HABs toxins有害藻華毒素赤潮毒素是由有毒赤潮生物產(chǎn)生的有毒天然有機(jī)化合物，危害較大的幾種毒素是麻痹性貝毒(PSP）、腹泄性貝毒（DSP）、神經(jīng)性貝毒（NSP）、失憶性貝毒（ASP）等。3.3 麻痹性貝類毒素 paralytic shellfish poisoning，PSP化學(xué)結(jié)構(gòu)以石房蛤毒素（Saxitoxin）為代表的，攝食后可產(chǎn)生麻痹作用的存在于貝類體內(nèi)的海洋生物毒性物質(zhì)的總稱。3.4 腹瀉性貝類毒素 diarrhetic shellfish poisoning，DSP化學(xué)結(jié)構(gòu)以軟海綿酸（Okadaic acid，OA）為代表的，攝食后可產(chǎn)生腹瀉作用的存在于貝類體內(nèi)

13、的海洋生物毒性物質(zhì)的總稱。 3.5 神經(jīng)性性貝類毒素 neurotoxic shellfish poisoning，NSP化學(xué)結(jié)構(gòu)以短裸甲藻毒素為代表的一類存在于貝類體內(nèi)的海洋生物毒性物質(zhì)的總稱。3.6記憶缺失性貝類毒素 amnesic shellfish poisoning，ASP化學(xué)結(jié)構(gòu)以軟骨藻酸（Domoic Acid，DA）為代表的，攝食后引起一段時(shí)間內(nèi)喪失部分記憶的存在于貝類體內(nèi)的海洋生物毒性物質(zhì)的總稱。3.7 滅菌 sterilization 用理化方法殺死一定物質(zhì)中的微生物的微生物學(xué)基本技術(shù)。3.8稀釋度 dilution試液被稀釋的程度（倍數(shù)） 。3.9 無菌操作 asepti

14、c technique用于防止微生物進(jìn)入人體組織或其它無菌范圍的操作技術(shù)稱為無菌操作。3.10 培養(yǎng)基 culture medium供微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的人工制品。3.11平板(皿)計(jì)數(shù) plate count根據(jù)細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說一個(gè)菌落即代表一個(gè)單細(xì)胞。3.12菌落 colony單個(gè)微生物在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長(zhǎng)繁殖到一定程度，形成肉眼可見有一定形態(tài)結(jié)7 / 59 文檔可自由編輯打印構(gòu)的子細(xì)胞的群落。3.13腸球菌 intestinal enterococci可在含乙酸鉈，萘啶酮酸和 2，3，5-三甲基氯化四

15、氮唑（TTC）的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，可以水解 4-甲基傘型酮酰-葡萄糖苷（MUD） ，44下好氧培養(yǎng)的微生物。4小型浮游生物的測(cè)定顯微鏡個(gè)體計(jì)數(shù)法4.1技術(shù)要求4.1.1采水4.1.1.1采水量：水深大于 200m 的海區(qū)，每次采水不少于 1000cm3；水深小于 200m 的海區(qū)不少于 500cm3；發(fā)生富營(yíng)養(yǎng)化或赤潮海區(qū)視具體情況而定，一般每次采水 100cm3。4.1.1.2采水層次：見表 1，具體層次視不同調(diào)查項(xiàng)目的要求確定，若需要詳細(xì)了解其垂直分布，可按表層、3、5、10、15、20、30m 和底層等層次采樣。表 1 采水層次 測(cè)站水深范圍米標(biāo)準(zhǔn)層次米底層與相鄰標(biāo)準(zhǔn)層的最小距離米10表

16、層、中層、底層250表層、10、30、底層2.5表層指海面下 0.5m 深度以內(nèi)的水層。水深小于 50m 時(shí)，底層為離底不足 2m 的水層。水深在 50200m 時(shí)，底層離底的距離為不足水深的 5% 。 可根據(jù)調(diào)查的特殊需要，酌情增加200m 以深的采水層次。條件許可時(shí)，應(yīng)充分考慮躍層和采集葉綠素次表層最大值所處的水層。水溫調(diào)查確定了溫躍層以后，在溫躍層區(qū)增加一個(gè)水層。4.1.2垂直拖網(wǎng)詳細(xì)分析小型浮游生物種類組成時(shí)采用拖網(wǎng)自海地至水面垂直拖網(wǎng)采樣，水深大于 200m 的海區(qū)拖網(wǎng)深度為 200m，水深小于 200m 的海區(qū)拖網(wǎng)深度從底至表。4.1.3垂直分段拖網(wǎng)若需了解其垂直分布，可作垂直分層

17、拖網(wǎng)。根據(jù)測(cè)站深度規(guī)定采集水層如表 2。表 2 小型浮游生物垂直分段拖網(wǎng)采樣水層 測(cè)站水深 米采樣水層米 200100，2010，3020，5030，10050，2001004.1.4連續(xù)觀測(cè)時(shí)間與次數(shù)水深小于50m的海區(qū)每3h采樣一次，共采9次；水深大于50m的海區(qū)每4h采樣一次，共采7次。4.1.5種類鑒定與計(jì)數(shù)8 / 59 文檔可自由編輯打印除需作特殊處理的生物種類以及培養(yǎng)觀察的特殊類群之外，鑒定到種的標(biāo)本比例應(yīng)在80%以上；鑒定到屬的比例應(yīng)在90%以上。水采樣品每次實(shí)際標(biāo)本鏡檢數(shù)不少于100200個(gè)；網(wǎng)采樣品每次實(shí)際標(biāo)本鏡檢數(shù)不少于500個(gè)。4.2調(diào)查要素調(diào)查要素包括小型浮游生物的種類

18、組成、優(yōu)勢(shì)種和數(shù)量分布（時(shí)間、空間） 。4.3采樣4.3.1采樣儀器設(shè)備4.3.1.1采水器采水器容積可為 2.5dm3、5dm3或 10dm3。4.3.1.2網(wǎng)具網(wǎng)具根據(jù)調(diào)查海區(qū)情況和采樣對(duì)象選用，見表 3。表 3 各種網(wǎng)具的規(guī)格及適用對(duì)象序號(hào)網(wǎng)具名稱網(wǎng)長(zhǎng)cm網(wǎng)口內(nèi)徑cm網(wǎng)口面積m2篩絹規(guī)格（孔徑近似值）mm適用范圍及采集對(duì)象1小型浮游生物網(wǎng)280370.1JF 62(0.077)JP 80(0.077)適用于30m 以深垂直或分段采集小型浮游生物2淺水 型浮游生物網(wǎng)140370.1JF 62(0.077)JP 80(0.077)適用于30m 以淺垂直或分段采集小型浮游生物3手拖定性浮游植物

19、網(wǎng)60220.038NY20HC(0.020)NY10HC(0.010)用以小型和微型浮游生物的種類組成分析以及藻種的分離篩絹規(guī)格見GB 2014。4.3.1.3網(wǎng)底管浮游生物網(wǎng)收集標(biāo)本的裝置，網(wǎng)底管套的篩絹必須與網(wǎng)衣篩絹的規(guī)格相同。4.3.1.4網(wǎng)口流量計(jì)使用前應(yīng)經(jīng)過標(biāo)定，每航次標(biāo)定一次。使用時(shí)安裝于網(wǎng)口半徑的中點(diǎn)，通過水流驅(qū)動(dòng)其葉輪轉(zhuǎn)動(dòng)，記錄器記錄轉(zhuǎn)數(shù)。標(biāo)定方法是將流量計(jì)按實(shí)際使用時(shí)的位置，安裝在不帶網(wǎng)衣的網(wǎng)圈上，并按實(shí)際采樣時(shí)的拖網(wǎng)速度從一定深度（10m 或 30m）垂直拖至表層，記錄其轉(zhuǎn)數(shù)。如此反復(fù) 5 次10 次，取得平均值，再計(jì)算每轉(zhuǎn)的流量。此值至少保留三位有效數(shù)字。4.3.1.5

20、量角器角弧形量角器。4.3.1.6沉錘根據(jù)水流速度和風(fēng)浪大小，使用重量為10kg40kg的鉛制沉錘。4.3.1.7絞車及鋼絲繩絞車變速范圍為0.3m/s1m/s，并附有排纜裝置和鋼絲繩計(jì)數(shù)器，鋼絲繩直徑為3.6mm5.0mm。4.3.1.8吊桿高度為5m6m（深水拖網(wǎng)須大于6m），負(fù)荷為500kg1000kg；吊桿的舷間距1m左右，并能調(diào)節(jié)位置。4.3.1.9沖水設(shè)備水泵、水管、水桶和吸水球等，用于沖噴收集粘貼在網(wǎng)衣或網(wǎng)底管套篩絹上的標(biāo)本。4.3.1.10閉鎖器9 / 59 文檔可自由編輯打印垂直分層拖網(wǎng)采集時(shí)，控制浮游生物網(wǎng)網(wǎng)口關(guān)閉裝置。4.3.2采樣前的準(zhǔn)備4.3.2.1根據(jù)調(diào)查要素、站數(shù)

21、、層次計(jì)算采樣數(shù)量，配以足量的樣品瓶、采樣工具、相應(yīng)的固定劑、記錄表及其它器材。裝箱上船并放于適當(dāng)位置，避免碰撞和丟失。4.3.2.2固定液配置以下固定液：a) 魯哥氏液（Lugols solution）：100g 碘化鉀溶于 1dm3蒸餾水，加入 50g 碘使其溶解，再加入 100cm3冰醋酸。b) 緩沖甲醛溶液：商用甲醛（40%）加入同量蒸餾水，1dm320%的甲醛溶液加 100g 六次甲基四胺。4.3.3海上采樣與樣品保存 4.3.3.1采水使用采水器按預(yù)定水層和規(guī)定量采集小型浮游生物標(biāo)本，并裝入標(biāo)本瓶，樣品用魯哥氏液或緩沖甲醛溶液固定，加入量分別為樣品體積的1%和5%，視樣品實(shí)際濃度可

22、作適當(dāng)增減，并記錄于表A.1。4.3.3.2垂直拖網(wǎng)采樣 垂直拖網(wǎng)采樣主要采集水柱中個(gè)體小于 200m 的絕大部分小型浮游生物樣品，如無殼纖毛蟲、砂殼纖毛蟲、輪蟲、橈足類幼體、放射蟲和有孔蟲等樣品。按不同水深選用小型浮游生物網(wǎng)或淺水 III 型浮游生物網(wǎng)進(jìn)行垂直拖網(wǎng)，每次下網(wǎng)前應(yīng)檢查網(wǎng)具是否破損，發(fā)現(xiàn)破損應(yīng)及時(shí)修補(bǔ)或更換網(wǎng)具；檢查網(wǎng)底管和流量計(jì)是否處于正常狀態(tài)，并把流量計(jì)指針撥至零；放網(wǎng)入水，當(dāng)網(wǎng)口貼近水面時(shí)，須調(diào)整計(jì)數(shù)器指針于零的位置；落網(wǎng)速度為0.5m/s；以鋼絲繩保持緊直為準(zhǔn)；當(dāng)網(wǎng)具接近海底時(shí)，絞車應(yīng)減速，當(dāng)沉錘著底，鋼絲繩出現(xiàn)松弛時(shí)，應(yīng)立即停車，記下繩長(zhǎng)。網(wǎng)具到達(dá)海底后立即起網(wǎng)，起網(wǎng)速

23、度為 0.5m/s0.8m/s，網(wǎng)口未露出水面前不可停車，把網(wǎng)升至適當(dāng)高度，用沖水設(shè)備自上而下反復(fù)沖洗網(wǎng)衣外表面（切勿使沖洗的海水進(jìn)入網(wǎng)口），使粘附于網(wǎng)上的標(biāo)本集中于網(wǎng)底管內(nèi)，將網(wǎng)收入甲板，開啟網(wǎng)底管活門，把標(biāo)本裝入標(biāo)本瓶，樣品用緩沖甲醛溶液固定，加入量為樣品體積的 5%，根據(jù)樣品的實(shí)際濃度可作適當(dāng)增減，并記錄于表 A.1。用手拖定性浮游植物網(wǎng)進(jìn)行水平（可在網(wǎng)口三根網(wǎng)繩的接合點(diǎn)加一個(gè)使錘）或垂直拖網(wǎng)，樣品用魯哥氏液或緩沖甲醛溶液固定；如需對(duì)樣品做電鏡觀察分析，則選用戊二醛固定，根據(jù)樣品濃度可加入樣品體積的 2%5%。4.3.3.3分層垂直拖網(wǎng)應(yīng)在網(wǎng)具上安裝閉鎖器，按規(guī)定層次逐一采樣。下網(wǎng)時(shí)按垂

24、直拖網(wǎng)方法；網(wǎng)具降至預(yù)定采樣水層下界時(shí)應(yīng)立即起網(wǎng)，當(dāng)網(wǎng)具將達(dá)采樣水層上界時(shí)，應(yīng)減慢速度，提前打下使錘，當(dāng)鋼絲繩出現(xiàn)瞬間松弛或震動(dòng)時(shí)，說明網(wǎng)已關(guān)閉。按垂直拖網(wǎng)方法收集固定標(biāo)本，分層采樣情況記錄于表A.2。4.3.3.4注意事項(xiàng)遇傾角超過45，應(yīng)加重沉錘重新采樣；遇網(wǎng)口刮船底或海底，應(yīng)重新采樣。4.4樣品分析4.4.1主要儀器和設(shè)備光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡、沉降器、濾器、支架、抽濾瓶、手持泵或真空泵。4.4.2樣品編號(hào)各類樣品應(yīng)有總編號(hào)。總編號(hào)由代表采樣海區(qū)、采樣方式、使用網(wǎng)型、采樣年份和樣品序號(hào)等內(nèi)容的代號(hào)依次組成，每份貯存樣品的瓶外須貼有總編號(hào)的外標(biāo)簽，瓶?jī)?nèi)應(yīng)放有總編號(hào)、站號(hào)和采樣日期等內(nèi)容的內(nèi)

25、標(biāo)簽，填寫表3A.3。10 / 59 文檔可自由編輯打印4.4.3樣品分類鑒定標(biāo)本鑒定宜采用活體與固定樣品相結(jié)合、網(wǎng)采與水采樣品相結(jié)合的方法；定量計(jì)數(shù)應(yīng)以采水樣品為準(zhǔn)，水柱的定量計(jì)數(shù)以網(wǎng)采樣品為準(zhǔn)，網(wǎng)采樣品可作為種類組成分析的補(bǔ)充和某些個(gè)體大于拖網(wǎng)篩絹孔徑的種類的定量計(jì)數(shù)。4.4.4豐度測(cè)定4.4.4.1沉降計(jì)數(shù)法用于采水樣品小型浮游生物計(jì)數(shù)，見附錄1.2.1，計(jì)數(shù)結(jié)果記錄于附表A.4。4.4.4.2濃縮計(jì)數(shù)法用于網(wǎng)采或采水樣品小型浮游生物計(jì)數(shù)，見附錄1.2.2，計(jì)數(shù)結(jié)果記錄于附表A.5。4.4.4.3直接計(jì)數(shù)法適于赤潮發(fā)生期間或小型浮游生物細(xì)胞數(shù)量達(dá)每升105個(gè)以上時(shí)，用于網(wǎng)采或采水樣品小型

26、浮游生物計(jì)數(shù)，見附錄1.2.2，計(jì)數(shù)結(jié)果記錄于附表A.5。4.5資料整理4.5.1豐度計(jì)算采水和網(wǎng)采小型浮游生物數(shù)量分別以cells/dm3和cells/m3表示。4.5.2光學(xué)顯微鏡計(jì)算4.5.2.1a) 沉降計(jì)數(shù)法計(jì)算 （1）iViNC 式中：C單位體積海水中標(biāo)本總量，單位為個(gè)每毫升（cells/cm3）；Ni三個(gè)分樣計(jì)數(shù)的標(biāo)本總個(gè)數(shù)，單位為個(gè)（cells）；Vi三個(gè)分樣的總體積，單位為毫升（cm3）。4.5.2.2b) 濃縮計(jì)數(shù)法計(jì)算網(wǎng)采樣品： （2）nVVVnC21式中：C單位體積海水中標(biāo)本總量，單位為個(gè)每立方米（cells/m3）；n取樣計(jì)數(shù)個(gè)數(shù)，單位為個(gè)（cells）；V1水樣濃縮

27、后的體積，單位為毫升（cm3）；V2濾水量，單位為立方米（m3）；Vn取樣計(jì)數(shù)的體積，單位為毫升（cm3）。采水樣品： （3）21nVVVnC式中：C單位體積海水中標(biāo)本總量，單位為個(gè)每升（cells/dm3）；n取樣計(jì)數(shù)個(gè)數(shù)，單位為個(gè)（cells）；11 / 59 文檔可自由編輯打印V1水樣濃縮后的體積，單位為毫升（cm3）;V2原采水量，單位為升（dm3）；Vn取樣計(jì)數(shù)的體積，單位為毫升（cm3）4.5.2.3c) 直接計(jì)數(shù)法計(jì)算與濃縮計(jì)數(shù)法計(jì)算類同。4.6填寫統(tǒng)計(jì)表a) 按要求將上述統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)填入相應(yīng)的表格中。b) 按分類系統(tǒng)和種類出現(xiàn)季節(jié)，將上述各種表格數(shù)據(jù)匯總于附表A.6和附表A.7

28、。4.7繪制分布圖用Surfer繪圖軟件繪制細(xì)胞豐度平面分布圖。繪制方法如下：a) 繪制小型浮游生物細(xì)胞豐度平面分布圖，一般用等值線表示，取值標(biāo)準(zhǔn)如下：小型浮游生物細(xì)胞數(shù)量(網(wǎng)采樣品單位為 104cells/m3, 采水樣品單位為102cells/dm3): 5，10，50，100，500，1 000，5 000，10 000； b) 繪制小型浮游生物優(yōu)勢(shì)種豐度平面分布圖，一般用等值線表，取值標(biāo)準(zhǔn)如下：小型浮游生物優(yōu)勢(shì)種細(xì)胞數(shù)量(網(wǎng)采樣品單位為 104cells/m3, 采水樣品單位為 102cells/dm3): 1，5，10，50，100，500，1 000，5 000；c) 以上取值標(biāo)準(zhǔn)

29、，可視具體情況酌情增減。5赤潮甲藻孢囊檢測(cè)光鏡法5.1調(diào)查內(nèi)容5.1.1生物調(diào)查 鑒定沉積物中藻類的孢囊，測(cè)定密度和生物量，分析其相對(duì)豐度和群落多樣性。 5.1.2環(huán)境調(diào)查 環(huán)境特點(diǎn)海區(qū)的地理環(huán)境、形態(tài)和沉積物等；水文氣象天氣狀況、水溫、水深；沉積物粒度、有機(jī)質(zhì)、底溫。5.2調(diào)查方法5.2.1調(diào)查準(zhǔn)備調(diào)查之前，應(yīng)了解調(diào)查水域的基本狀況，制定調(diào)查方案。調(diào)查水域的基本狀況包括沿岸的海岸工程、海區(qū)的沉積物類型等。5.2.2站位布設(shè)站位的布設(shè)應(yīng)根據(jù)監(jiān)控區(qū)的位置和分布，結(jié)合海區(qū)的水文、水質(zhì)、沉積物底質(zhì)的環(huán)境資料綜合考慮。應(yīng)盡量避免在粒徑大的砂底布設(shè)站位。5.2.3調(diào)查類型和次數(shù) 基線（背景）調(diào)查：宜每月

30、一次，按生物季節(jié)（春3-5月、夏6-8月、秋9-11月、冬12-2月）宜一年調(diào)查4次。監(jiān)測(cè)性調(diào)查：根據(jù)各地實(shí)情和需要，選擇若干固定月分和若干站點(diǎn)定期取樣分析。應(yīng)急調(diào)查；若遇赤潮等，應(yīng)跟蹤監(jiān)測(cè)。5.2.4取樣面積、次數(shù)和手段 在水深10米以內(nèi)的港灣中或無動(dòng)力設(shè)備的小船上，采泥樣宜使用0.05m2采泥器，每站取1次。水深10米以上，或水流較大的海域，可用0.lm2 采泥器，每站取1次。5.3樣品采集5.3.1采集工具和設(shè)備 5.3.1.1采泥器12 / 59 文檔可自由編輯打印曙光采泥器：兩瓣的張口面積為0.lm2。深水500m 以上采泥時(shí)，應(yīng)換上帶重錘的掛鉤，并在兩額瓣的外面附加配重，以增加采泥

31、器的重量。“大洋一50型采泥器，取樣面積為0. 05m。適于無動(dòng)力設(shè)備的小船在內(nèi)灣取樣。日產(chǎn)TFO重力采泥器，適用于風(fēng)平浪靜的淺水內(nèi)灣沉積物的采集。5.3.1.2其它工具 需要配備鋼板尺，100mL白色塑料瓶、平鏟、保溫箱、冰袋。5.3.1.3甲板設(shè)備絞車、吊桿絞車和吊桿的負(fù)荷應(yīng)能滿足采泥的需要，吊桿宜裝在主甲板后部，高出船舷5m左右，舷間距約lm，可作回轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。專用于采泥器取樣的絞車及吊桿應(yīng)能負(fù)荷500kg，吊桿高出船舷的程度應(yīng)盡量減小，以能使用為度。鋼絲繩拖網(wǎng)一般可用直徑8-10mm的軟質(zhì)鋼絲繩。其長(zhǎng)度按調(diào)查海區(qū)的水深確定，備有足夠用量。在專供采泥用的絞車上，宜用直徑4-6mm的軟質(zhì)鋼絲繩

32、。在鋼絲繩與采泥器相連接處應(yīng)裝有轉(zhuǎn)環(huán)，以防操作過程鋼絲繩扭曲或打結(jié)。5.3.2樣品采集和處理5.3.2.1采泥樣 5.3.2.1.1曙光采泥器的操作 曙光彩泥器的操作按以下步驟操作：a) 投放：將采泥器活門上的鐵鏈掛在掛鉤上，慢慢開動(dòng)絞車，提升采泥器。隨著鋼絲繩拉緊，兩9瓣自動(dòng)張開。采泥器上升到略超過船舷時(shí)，即轉(zhuǎn)動(dòng)吊桿將其送出舷外，待穩(wěn)定后慢速下降，入水后再快速下降。放出的鋼絲繩可稍長(zhǎng)于水深。在淺海采樣時(shí)，當(dāng)放出的鋼絲繩松弛時(shí)，即采泥器已著底，應(yīng)立即停車，以防鋼絲繩打結(jié)。在深水采樣時(shí)，可根據(jù)鋼絲繩傾角的大小，加適當(dāng)?shù)挠嗔俊) 提升：開始用慢速，離底后改用快中速，接近水面時(shí)，再用慢速。當(dāng)采泥器

33、超過船舷時(shí)，應(yīng)立即停車，轉(zhuǎn)動(dòng)吊桿使之移近船舷或用鐵鉤將其鉤入舷內(nèi)，再慢慢下降，將采泥器放在一個(gè)預(yù)先準(zhǔn)備好的白鐵盤中。將領(lǐng)瓣打開，使沉積物完整的落到白鐵盤中。5.3.2.1.2大洋采泥器的操作大洋采泥器的投放和提升與曙光采泥器相同。5.3.2.1.3TFO 采泥器的操作在第二部分鋼管中放一根有機(jī)玻璃管，和第一、第二、第三依次擰緊，然后將鋼球從第三部分上面放下去；將第四部分也擰上，然后將繩子系上；將采泥器垂直落下，插入水中；將采泥器輕輕拿起，并保持垂直向上，以免攪動(dòng)表層沉積物；將一個(gè)橡膠塞從尖頭部分塞入有機(jī)玻璃，將其末端堵住；擰開采泥器尖頭部分，并將橡膠塞用力塞緊，小心垂直取出玻璃管；觀察玻璃管上

34、端應(yīng)有一段水柱，否則重采；玻璃管上端也用橡膠塞堵住，寫好標(biāo)簽，用錫紙將整個(gè)管包好，以免陽光照射，冷藏存于實(shí)驗(yàn)室中。5.3.2.2樣品收集、保存表層沉積物分析時(shí)，用鋼板尺由沉積物表層向下量出3cm，然后用平鏟將表層3cm的泥樣鏟下，然后分裝到6個(gè)樣品瓶中，分別用于水含量的測(cè)定、孢囊的鑒別及計(jì)數(shù)、備用樣的保存，樣品要裝到樣品瓶的2/3以上（樣品瓶為100g裝）。樣品瓶隨后放到低溫冷藏箱內(nèi)，避光保存。低溫運(yùn)回到實(shí)驗(yàn)室后，在4冰箱，冷藏保存2年以上。柱狀沉積物分析時(shí)，以2cm為高度單位分裝入樣品瓶中，分別標(biāo)記為0-2cm，2-4cm，4-6cm樣品瓶隨后放到低溫冷藏箱內(nèi)，避光保存。低溫運(yùn)回到實(shí)驗(yàn)室后，

35、在4冰箱，冷藏保存2年以上。5.3.3室內(nèi)標(biāo)本處理5.3.3.1標(biāo)本核對(duì)13 / 59 文檔可自由編輯打印檢查全部標(biāo)本編號(hào)、數(shù)量等與海上記錄表的內(nèi)容是否相符。遇有不符，應(yīng)及時(shí)查找。5.3.3.2孢囊樣品分離稱取一定量（10g）的待分析的沉積物，在培養(yǎng)皿中用海水稀釋，倒入燒杯中，超聲波處理30s，然后倒入80m網(wǎng)篩，收集過濾液，并聚集于20m網(wǎng)篩中，將20m目網(wǎng)篩中的殘留物質(zhì)轉(zhuǎn)至凸底表面皿中，加海水于皿中，用洗瓶中過濾海水噴射殘留物使水流環(huán)行，孢囊和其它輕物質(zhì)懸浮，重物質(zhì)沉于皿底，將上浮的懸浮液倒入燒杯中，然后再清洗皿中的殘留物數(shù)次，倒入燒杯中，然后將燒杯超聲波10s左右，再經(jīng)過20m篩絹過濾，

36、將殘留在篩絹上的孢囊沖洗到帶刻度的離心管中，定容到5mL。樣品在過濾前后都應(yīng)盡量保存在黑暗、低溫（4）的條件下。5.3.3.3孢囊的觀察及鑒定按標(biāo)本序號(hào)順序鑒定標(biāo)本，并按表B.1各項(xiàng)測(cè)定和填寫。利用光學(xué)顯微鏡觀察孢囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，根據(jù)孢囊形狀、表面突起、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、個(gè)體顏色、副板塊結(jié)構(gòu)和萌發(fā)孔等特征對(duì)孢囊的種類進(jìn)行鑒定。對(duì)主要種應(yīng)盡可能鑒定到種，對(duì)形態(tài)觀察難以確定的種類，需要進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，以確定分類地位。定量觀察時(shí)，吸取0.1mL0.5mL已處理過的樣品至1mL方格計(jì)數(shù)框中，重復(fù)觀察數(shù)次，使每個(gè)樣品至少觀察到200個(gè)孢囊。重復(fù)幾次后平均，再乘以體積，除以泥樣的重量（干重） ，得出單位泥樣（干重）

37、中孢囊的數(shù)量。 5.3.3.4孢囊的萌發(fā)培養(yǎng)取1mL已處理過的孢囊樣品，均勻后倒在1mL計(jì)數(shù)框上。在倒置顯微鏡下，用微細(xì)管挑取所需孢囊在細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔加入適量的f/2培養(yǎng)液，可根據(jù)不同需要選用不同的培養(yǎng)液，每孔放一個(gè)孢囊，周圍用密封帶封閉，避免蒸發(fā)。把培養(yǎng)板置于（201）（或其它適宜溫度下）恒溫培養(yǎng)箱，光周期為12h：12h或其它比例，培養(yǎng)條件可根據(jù)不同種類和生態(tài)類型進(jìn)行選擇，每天觀察萌發(fā)情況。6赤潮毒素檢測(cè)6.1麻痹貝毒的檢驗(yàn)ELISA 法6.1.1原理本方法的測(cè)定原理是競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)反應(yīng)。將已知抗原吸附在固相載體表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗體與待測(cè)樣品(含有抗原)提取液的混

38、合液，競(jìng)爭(zhēng)溫育后，在固相載體表面形成抗原-抗體復(fù)合物。洗除多余抗體成分，然后加入酶標(biāo)記的抗球蛋白的第二抗體結(jié)合物，與吸附在固體表面的抗原-抗體復(fù)合物相結(jié)合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物，通過酶標(biāo)檢測(cè)儀，測(cè)出酶底物的降解量，從而推知被測(cè)樣品中的抗原量。6.1.2試劑和材料除另有規(guī)所有化學(xué)試劑均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水。6.1.2.10.1mol/L 鹽酸。6.1.2.25mol/L 鹽酸。6.1.2.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃縮液：經(jīng)酸化，含有 20%的乙醇作為保護(hù)劑，冷凍時(shí)，無限期穩(wěn)定。6.1.2.4抗體濃縮液6.1.2.5抗原：PSP 與載體蛋白-卵清蛋白(O

39、VA)的結(jié)合物。6.1.2.6兔抗鼠免疫球蛋白與辣根過氧化酶的結(jié)合物(酶標(biāo)二抗)。6.1.2.7ELISA 包被緩沖液為 pH9.6 的碳酸鹽緩沖液，稱取 1.59g 碳酸鈉(Na2CO3)，2.93g 碳酸氫鈉(NaHCO3)，加水稀釋至 1000mL，在 4冰箱保存。6.1.2.81%PVA-PBS：1g 聚乙烯醇（PVA）溶于 100mLPBS 緩沖溶液中。14 / 59 文檔可自由編輯打印6.1.2.9洗液為含 0.05%吐溫-20 的 pH7.4 的磷酸鹽緩沖液(簡(jiǎn)稱為 PBS-T)配制方法為：稱取磷酸二氫鈉(KH2PO42H20)0.3g，磷酸氫二鈉(Na2HPO412H20)1.

40、13g，氯化鈉(NaCl)8.0g，吐溫-20 0.5mL，加水至 1000mL。6.1.2.10底物液 A：稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO412H20) 4.6g，檸檬酸(C6H8O7H2O) 2.55g，過氧化脲（CH6N2O3）0.25g，加水至 500 mL，即可。6.1.2.11底物液 B：稱取 3, 3, 5, 5四甲基聯(lián)苯胺（TMB）0.125 g，溶于 2.5 mL 二甲亞砜中，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA2Na）0.075g，檸檬酸(C6H8O7H2O)0.525g，加水至 500 mL，即可。6.1.2.12底物液：將底物液 A 與底物液 B1:1 比例混合即可。6.1.2.1

41、3反應(yīng)終止液：2M 硫酸。6.1.2.14PH 7.4 的磷酸鹽緩沖液：稱取磷酸二氫鈉(KH2PO42H20)0.3g，磷酸氫二(Na2HPO412H20)1.13g，氯化鈉(NaCl)8.0g，加水至 1000mL。用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)及樣品。6.1.3商業(yè)化試劑盒若測(cè)定低限，回收率達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的要求，則也適用于本標(biāo)準(zhǔn)。6.1.3儀器和設(shè)備6.1.3.1酶標(biāo)檢測(cè)儀。6.1.3.296 孔酶標(biāo)板。6.1.3.3均質(zhì)器。6.1.3.4離心機(jī)。6.1.3.5電動(dòng)振蕩器。6.1.3.6微量加樣器：50L、100L、500L。6.1.3.70.45m 微孔濾膜。6.1.4測(cè)定步驟6.1.4.1貝類分析樣品的采集

42、分析樣品的采集應(yīng)有充分的代表性，依受檢貝類品種決定樣品的采集量。每種去殼肉量應(yīng)達(dá)到 200g。新鮮貝類不能及時(shí)送檢，樣品應(yīng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存，備檢。6.1.4.2試樣制備 不同樣品的制備程序如下：a) 貝類試樣制備。用清水將貝殼外表徹底洗凈，除去貝殼，用雙蒸水拎洗貝肉，除去泥沙及其他外來物，收集約 200g 肉置于篩中瀝水 5min（不要使肉堆積） ，揀出碎殼等雜物。將貝肉均質(zhì)。稱取 10g 均質(zhì)后的樣品加入 0.1mol/L 的鹽酸 10mL（如果樣品為較干燥的貝肉，可加入 20mL 0.1mol/L 鹽酸，稀釋系數(shù)等同） ，水浴煮沸并攪拌 5min。冷卻至室溫，4下，3500r/

43、min 離心 10min（離心后可能有懸濁，不影響結(jié)果） 。離心后控制 pH值，用 5mol/L 的鹽酸溶液調(diào)節(jié)到 4.0 以下，取 100L 上清液，用 pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液稀釋到 10mL（1000 倍稀釋） ，取 50L 進(jìn)行酶聯(lián)免疫測(cè)定。此時(shí)的稀釋倍數(shù)為 2000 倍；b) 藻類試樣制備。準(zhǔn)確記取預(yù)檢藻類細(xì)胞數(shù)量，3000r/min 離心 10min，棄上清后向內(nèi)加入0.1mol/L 的鹽酸 10mL，充分?jǐn)噭颍{(diào) PH 為 3-4，采用超聲破碎或機(jī)械研磨技術(shù)破碎藻類細(xì)胞；再次離心，用 0.45m 微孔濾膜過濾上清液；濾液置于試管內(nèi)，水浴煮沸并攪拌5min，冷卻至室溫，再調(diào) P

44、H 值到 4.0 以下，后用 0.1mol/L 的鹽酸定容至 15mL，該溶液即為 PSP 提取液，根據(jù)海藻試樣中 PSP 的含量用 PH 7.4 的磷酸鹽緩沖液適當(dāng)稀釋，取50L 進(jìn)行酶聯(lián)免疫測(cè)定；c) 海水試樣制備。收集 2mL 待檢海水樣品至試管中，為了防止 PSP 在玻璃管內(nèi)壁殘留，立即添加 0.5mL 海水預(yù)處理液，混勻。將該液體作為海水試樣進(jìn)行檢測(cè)6.1.4.3ELISA 檢測(cè)ELISA 檢測(cè)步驟如下：15 / 59 文檔可自由編輯打印a) 用 PSP-OVA(2g/mL)包被酶標(biāo)板，每孔 100L，4過夜；b) 棄去殘液，用洗液洗 96 孔酶標(biāo)板 3 次，每次 60s 后，用 1

45、%PVA-PBS 溶液封閉，每孔300L，37恒溫 3h，4保存待用；c) 酶標(biāo)板用 PBS-T 洗 3 次，每次 60s 后，加入不同濃度的 PSP 標(biāo)準(zhǔn)溶液(制作標(biāo)準(zhǔn)曲線)或樣品提取液與抗體溶液的混合液(1:1，每孔 100L，)，置 37，1h；d) 酶標(biāo)板洗 3 次，每次 3min 后，加入酶標(biāo)二抗，每孔 100L，37，40min；e) 同上述洗滌后，加入底物溶液，每孔 100L，37，13min；f) 用 0.5mol/L 硫酸溶液終止反應(yīng)，每孔 50L， 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。6.1.5結(jié)果的計(jì)算和表述6.1.5.1計(jì)算百分比吸光度值計(jì)算 PSP 毒素標(biāo)準(zhǔn)液和樣液的平均

46、吸光度值，按式（4）分別求得每個(gè) PSP 標(biāo)準(zhǔn)液和樣液的百分比吸光度值：（4）%1000SSA式中：A吸光度值的百分比；S6 個(gè)適當(dāng)?shù)?PSP 標(biāo)準(zhǔn)液和樣液的平均吸光度值；S00g/kg的 PSP 標(biāo)準(zhǔn)液的平均吸光度值。6.1.5.2繪制校正曲線以百分比吸光度值（算數(shù)級(jí)）為縱坐標(biāo)，以 PSP 溶液濃度（g/kg） （對(duì)數(shù)級(jí)）為橫坐標(biāo)，繪制出 PSP 標(biāo)準(zhǔn)液百分比吸光度值與 PSP 溶液濃度的校正曲線。每次試驗(yàn)均應(yīng)重新繪制校正曲線。6.1.5.3結(jié)果的計(jì)算在 6.1.5.2 繪制的校正曲線上讀取樣液百分比吸光度值所對(duì)應(yīng)的 PSP 濃度為試樣中 PSP 的含量（g/kg） 。從校正曲線讀出的濃度值

47、應(yīng)乘以相對(duì)應(yīng)的稀釋系數(shù)。6.1.5.4結(jié)果的表述當(dāng)測(cè)定值小于 50g/kg 時(shí)，報(bào)告 PSP 的含量為小于 50g/kg。當(dāng)測(cè)定值大于等于 50g/kg 時(shí)，報(bào)告 PSP 的實(shí)際測(cè)定值。6.1.6測(cè)定低限、回收率6.1.6.1測(cè)定低限本方法的測(cè)定低限為 50g/kg。6.1.6.2回收率本方法的回收率約為 90%6.1.7健康和安全PSP 含量值大于 800g/kg（國(guó)際慣例表示方式為 80g/100g）的樣品被認(rèn)為是有害的，對(duì)人類食用不安全。注：PSP 含量值 800g/kg 的國(guó)際慣例表示方式為 80g/100g。標(biāo)準(zhǔn)液含有 PSP，應(yīng)小心操作，避免接觸。反應(yīng)終止液為 2mol/L 硫酸，

48、避免接觸皮膚。6.1.8注意事項(xiàng)所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，再依次用自來水、蒸餾水沖洗。6.2腹瀉性貝毒的檢驗(yàn)ELISA 法6.2.1原理本方法的測(cè)定原理是競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)反應(yīng)。將已知抗原吸附在固相載體表面，洗除16 / 59 文檔可自由編輯打印未吸附抗原，加入一定量抗體與待測(cè)樣品(含有抗原)提取液的混合液，競(jìng)爭(zhēng)溫育后，在固相載體表面形成抗原-抗體復(fù)合物。洗除多余抗體成分，后加入酶標(biāo)記的抗球蛋白的第二抗體結(jié)合物，與吸附在固體表面的抗原-抗體復(fù)合物相結(jié)合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物，通過酶標(biāo)檢測(cè)儀，測(cè)出酶底物的降解量，從而推知被測(cè)樣品中的抗原量。6.

49、2.2試劑和材料除另有規(guī)所有化學(xué)試劑均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水。6.2.2.1甲醇。6.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃縮液：經(jīng)酸化，含有 20%的乙醇作為保護(hù)劑，冷凍時(shí)，無限期穩(wěn)定。6.2.2.3抗體濃縮液6.2.2.4抗原：腹瀉性貝毒與載體蛋白-卵清蛋白(OVA)的結(jié)合物(DSP-OVA)。6.2.2.5兔抗鼠免疫球蛋白與辣根過氧化酶的結(jié)合物(酶標(biāo)二抗)。6.2.2.6ELISA 包被緩沖液為 pH9.6 的碳酸鹽緩沖液，稱取 1.59g 碳酸鈉(Na2CO3)，2.93g 碳酸氫鈉(NaHCO3)，加水稀釋至 1000mL，在 4冰箱保存。6.2.2.71%PVA-PBS：1g 聚乙烯醇（

50、PVA）溶于 100mLPBS 緩沖溶液中。6.2.2.8洗液為含 0.05%吐溫-20 的 pH7.4 的磷酸鹽緩沖液(簡(jiǎn)稱為 PBS-T)配制方法為：稱取磷酸二氫鈉(KH2PO42H20)0.3g，磷酸氫二鈉(Na2HPO412H20)1.13g，氯化鈉(NaCl)8.0g，吐溫-20 0.5mL，加水至 1000mL。6.2.2.9底物液 A：稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO412H20) 4.6g，檸檬酸(C6H8O7H2O) 2.55g，過氧化脲（CH6N2O3）0.25g，加水至 500 mL，即可。6.2.2.10底物液 B：稱取 3, 3, 5, 5四甲基聯(lián)苯胺（TMB）0.125

51、 g，溶于 2.5 mL 二甲亞砜中，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA2Na）0.075g，檸檬酸(C6H8O7H2O)0.525g，加水至 500 mL，即可。6.2.2.11底物液：將底物液 A 與底物液 B1:1 比例混合即可。6.2.2.12反應(yīng)終止液：2M 硫酸。6.2.2.13商業(yè)化試劑盒若測(cè)定低限（或滿足國(guó)內(nèi)外限量要求），回收率達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的要求，則也適用于本標(biāo)準(zhǔn)。6.2.3儀器和設(shè)備6.2.3.1酶標(biāo)檢測(cè)儀。6.2.3.296 孔酶標(biāo)板。6.2.3.3均質(zhì)器。6.2.3.4離心機(jī)。6.2.3.5電動(dòng)振蕩器。6.2.3.6微量加樣器：50L、100L、500L。6.2.3.70.45m

52、微孔濾膜。6.2.4測(cè)定步驟6.2.4.1貝類分析樣品的采集分析樣品的采集要有充分的代表性，依受檢貝類品種決定樣品的采集量。但每種去殼肉量應(yīng)達(dá)到 200。新鮮貝類不能及時(shí)送檢，樣品應(yīng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存，備檢。6.2.4.2試樣制備6.2.4.2.1貝類試樣制備貝類式樣制備步驟如下：a) 用清水將貝殼外表徹底洗凈，除去貝殼，用雙蒸水拎洗貝肉，除去泥沙及其他外來物，收集約 200g 肉置于篩中瀝水 5min（不要使肉堆積） ，揀出碎殼等雜物，將貝肉均質(zhì)；17 / 59 文檔可自由編輯打印b) 稱取 2g 均質(zhì)后的樣品加入 8mL 80%的甲醇（甲醇 80：蒸餾水 20） ，4下，3500

53、g 離心10min，收集上清液；c) 加 8mL 80%的甲醇（甲醇 80：蒸餾水 20） ，到上步驟中的殘留貝類在組織中再離心，4下，3500g 離心 10min，收集上清液，加入到上步驟中收集到的上清液中；d) 重復(fù)步驟三，待收集的上清液達(dá)到 20mL 時(shí)，用 0.45m 的濾膜過濾；e) 取 100L 濾液，用蒸餾水稀釋到 10mL（100 倍稀釋） ，取 50L 進(jìn)行酶聯(lián)免疫測(cè)定。此時(shí)的稀釋倍數(shù)為 1000 倍。6.2.4.2.2藻類試樣制備準(zhǔn)確記取預(yù)檢藻類細(xì)胞數(shù)量，3000r/min 離心 10min，棄上清后采用超聲破碎或機(jī)械研磨技術(shù)破碎藻類細(xì)胞；向內(nèi)加入 10mL 80%的甲醇（

54、甲醇 80：蒸餾水 20）再次離心，用 0.45m 微孔濾膜過濾上清液；濾液置于試管內(nèi)，用 80%的甲醇定容至 20mL，該溶液即為 DSP 提取液，根據(jù)海藻試樣中 DSP 的含量用蒸餾水適當(dāng)稀釋，取 50L 進(jìn)行酶聯(lián)免疫測(cè)定。6.2.4.2.3海水試樣制備收集 2mL 待檢海水樣品至試管中，為了防止 DSP 在玻璃管內(nèi)壁殘留，立即添加 0.5mL 海水預(yù)處理液，混勻。將該液體作為海水試樣進(jìn)行檢測(cè)6.2.4.3ELISA 檢測(cè)a) 用 DSP-OVA(2g/mL)包被酶標(biāo)板，每孔 100L，4過夜；b) 棄去殘液，用洗液洗 96 孔酶標(biāo)板 3 次，每次 60s 后，用 1%PVA-PBS 溶液

55、封閉，每孔300L，37恒溫 3h，4保存待用。c) 酶標(biāo)板用 PBS-T 洗 3 次，每次 60s 后，加入不同濃度的 DSP 標(biāo)準(zhǔn)溶液(制作標(biāo)準(zhǔn)曲線)或樣品提取液與抗體溶液的混合液(1:1，每孔 100L，)，置 371h；d) 酶標(biāo)板洗 3 次，每次 3min 后，加入酶標(biāo)二抗，每孔 100L，3740min；e) 同上述洗滌后，加入底物溶液，每孔 100L，37，13min；f) 用 2mol/L 硫酸溶液終止反應(yīng)，每孔 50L， 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。6.2.5結(jié)果的計(jì)算和表述6.2.5.1計(jì)算百分比吸光度值計(jì)算腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)液和樣液的平均吸光度值，按式（5）分別求得每

56、個(gè) DSP 標(biāo)準(zhǔn)液和樣液的百分比吸光度值：（5）%1000SSA式中：A吸光度值的百分比；S6 個(gè)適當(dāng)?shù)?DSP 標(biāo)準(zhǔn)液和樣液的平均吸光度值；S00g/kg的 DSP 標(biāo)準(zhǔn)液的平均吸光度值。6.2.5.2繪制校正曲線以百分比吸光度值（算數(shù)級(jí)）為縱坐標(biāo)，以 DSP 溶液濃度（g/kg） （對(duì)數(shù)級(jí)）為橫坐標(biāo)，繪制出 DSP 標(biāo)準(zhǔn)液百分比吸光度值與腹瀉性貝類毒素溶液濃度的校正曲線。每次試驗(yàn)均應(yīng)重新繪制校正曲線。6.2.5.3結(jié)果的計(jì)算在 6.2.5.2 繪制的校正曲線上讀取樣液百分比吸光度值所對(duì)應(yīng)的 DSP 濃度即為試樣中 DSP 的含量（g/kg） 。從校正曲線讀出的濃度值應(yīng)乘以相對(duì)應(yīng)的稀釋系數(shù)。

57、6.2.5.4結(jié)果的表述當(dāng)測(cè)定值小于 50g/kg 時(shí)，報(bào)告 DSP 的含量為小于 50g/kg。18 / 59 文檔可自由編輯打印當(dāng)測(cè)定值大于等于 50g/kg 時(shí)，為 DSP 的實(shí)際測(cè)定值。6.2.6測(cè)定低限、回收率6.2.6.1測(cè)定低限本方法的測(cè)定低限為 50g/kg。6.2.6.2回收率本方法的回收率約為 90%6.2.7健康和安全任何 DSP 含量值大于 200g/kg（國(guó)際慣例表示方式為 20g/100g）的樣品即被認(rèn)為是有害的，對(duì)人類食用不安全。標(biāo)準(zhǔn)液含有 DSP，應(yīng)特別小心，避免接觸。反應(yīng)終止液為 2mol/L 硫酸，避免接觸皮膚。6.2.8注意事項(xiàng)所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡

58、，再依次用自來水、蒸餾水沖洗。6.3神經(jīng)性貝毒的檢驗(yàn)ELISA 法6.3.1原理本方法的測(cè)定原理是競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)反應(yīng)。微孔板包被有針對(duì)神經(jīng)性毒素（NSP）抗體的捕捉抗體，加入標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液及神經(jīng)性毒素（NSP）酶標(biāo)記物，游離神經(jīng)性毒素（NSP）與神經(jīng)性毒素（NSP）酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)神經(jīng)性毒素（NSP）抗體，同時(shí)神經(jīng)性毒素（NSP）抗體與捕捉抗體連接。沒有結(jié)合的酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將底物和發(fā)色劑加入到孔中并且孵育。結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色改變。在 450nm 測(cè)量，吸光強(qiáng)度與樣品中的濃度成反比。6.3.2試劑和材料除另有規(guī)所有化學(xué)試劑均為分

59、析純，水為蒸餾水或同等純度的水。6.3.2.1甲醇6.3.2.2濃縮液。6.3.2.3抗體濃縮液。6.3.2.4抗原：神經(jīng)性貝毒與載體蛋白-卵清蛋白(OVA)的結(jié)合物(NSP-OVA)。6.3.2.5兔抗鼠免疫球蛋白與辣根過氧化酶的結(jié)合物(酶標(biāo)二抗)。6.3.2.6ELISA 緩沖液系統(tǒng)。包被緩沖液為 pH9.6 的碳酸鹽緩沖液，稱取 1.59g 碳酸鈉(Na2CO3)，2.93g 碳酸氫鈉(NaHCO3)，加水稀釋至 1000mL。6.3.2.71%PVA-PBS6.3.2.8洗液為含 0.05%吐溫-20 的 pH7.4 的磷酸鹽緩沖液(簡(jiǎn)稱為 PBS-T)配制方法為：稱取磷酸二氫鉀(KH

60、2PO4)0.2g，磷酸氫二鈉(Na2HPO412H20)2.9g，氯化鈉(NaCl)8.0g，氯化鉀(KCl)0.2g，吐溫-200.5mL，加水至 1000mL。6.3.2.9底物緩沖液為 pH5.0 的磷酸-檸檬酸緩沖液，配制方法為：0.1mol/L 檸檬酸(C6H8O7H2O)，即稱取檸檬酸 19.2g，加水至 1000mL，為甲液；0.2mol/L 磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，即稱取磷酸氫二鈉 71.7g，加水至 1000mL，為乙液； 取甲液 24.3mL，乙液 25.7mL，加水至 100mL，即可。6.3.2.10溶液：取 50l TMB(10mgTMB 溶于 1mL 二甲基