1、微生物誘變育種的方法摘要: 介紹了幾種常用的物理誘變和化學誘變育種方法的原理、特點以及成功案例等 ,為微 生物誘變育種提供了一個總體的方法框架。關鍵詞 : 誘變 ; 微生物育種微生物與釀造工業、食品工業、生物制品工業等的關系非常密切， 其菌株 的優良與否直接關系到多種工業產品的好壞， 甚至影響人們的日常生活質量， 所 以選育優質、 高產的微生物菌株十分重要。 微生物育種的目的就是要把生物合成 的代謝途徑朝人們所希望的方向加以引導， 或者促使細胞內發生基因的重新組 合優化遺傳性狀， 人為地使某些代謝產物過量積累，獲得所需要的高產、優質 和低耗的菌種。 作為育種途徑之一的誘變育種一直被廣泛應用。

2、目前，國內微生 物育種界主要采用的仍是常規的物理及化學因子等誘變方法。1 物理誘變1.1 紫外照射紫外線照射是常用的物理誘變方法之一， 是誘發微生物突變的一種非常有 用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm,因此在260nm的紫 外輻射是最有效的致死劑。 紫外輻射的作用已有多種解釋， 但比較確定的作用是 使DNA分子形成嘧啶二聚體 。二聚體的形成會阻礙堿基間正常配對，所以可能導致突變甚至死亡 2。馬曉燕3等以紫外誘變原生質選育法篩選發酵乳清高產酒精菌株馬克斯克 魯維酵母菌株 ZR-20, 比優化前的酒精產率提高 10.5%,較出發菌株提高了 68%。 顧蕾等通過紫外誘變紅酵母

3、ns-1原生質體，獲得類胡蘿卜素產量明顯提高的突 變株，其生物量、色素產量分別為6.15g/L、6.41mg/L，分別比原始菌株提高了 67.6%、 54.1%。紫外照射誘變操作簡單， 經濟實惠， 一般實驗室條件都可以達到， 且出現正 突變的幾率較高，酵母菌株的誘變大多采用這種方法。1.2 電離輻射Y射線是電離生物學上應用最廣泛的電離射線之一，具有很高的能量，能產 生電離作用，可直接或間接地改變 DNA結構。其直接效應是可以氧化脫氧核糖 的堿基，或者脫氧核糖的化學鍵和糖 -磷酸相連接的化學鍵。其間接效應是能使 水或有機分子產生自由基， 這些自由基可以與細胞中的溶質分子發生化學變化， 導致DNA

4、分缺失和損傷。張偉5等將較高產酒精酵母制備成原生質體，經Zo誘變后，采用四級篩選， 得到高產酒精酵母菌株Co-158,其遺傳性狀穩定，其成熟醪酒精體積分數比出發 菌株提高了 16.34%，比ADY提高了 24.48%，殘還原糖含量亦遠遠低于出發菌株 和 ADY。除丫射線外的電離輻射還有X-射線、&射線和快中子等。電離輻射有一定的 局限性，操作要求較高， 且有一定的危險性， 通常用于不能使用其他誘變劑的誘 變育種過程。1.3 離子注入離子注入是 20世紀80年代初興起的一項高新技術， 主要用于金屬材料表面的 改性。 1986年以來逐漸用于農作物育種， 近年來在微生物育種中逐漸引入該技術

5、6。離子注入時， 生物分子吸收能量， 并且引起復雜的物理和化學上的變化， 這 些變化的中間體是各類活性自由基。 這些自由基， 可以引起其它正常生物分子的 損傷，可使細胞中的染色體突變，DNA鏈斷裂，也可使質粒DNA造成斷裂7,8,9。 由于離子注入射程具有可控性， 隨著微束技術和精確定位技術的發展，定位誘 變將成為可能 7。向砥10等用10keVN+誘變產壯觀霉素菌株Streptomycesspectabilisb使產量提 高102.3%。于廣成等用10keVN+誘變產灰黃霉素菌株Penicellliunpatulum，使產量 提高 26.8%11。除此之外，糖化酶生產菌、不飽和脂肪酸生產菌、

6、維生素生產菌 的離子束誘變效果也得到充分肯定。 這些表明，離子輻照處理是一種極有潛力的 微生物藥物的誘變育種新方法 12。離子注入法進行微生物誘變育種，一般實驗 室條件難以達到，目前應用相對較少。1.4 激光 激光是一種光量子流，又稱光微粒。激光輻射可以通過產生光、熱、壓力和電磁場效應的綜合應用，直接或間接地影響有機體，引起細胞染色體畸變效應、 酶的激活或鈍化， 以及細胞分裂和細胞代謝活動的改變。 光量子對細胞內含物中 的任何物質一旦發生作用， 都可能導致生物有機體在細胞學和遺傳學特性上發 生變異。不同種類的激光輻射生物有機體， 所表現出的細胞學和遺傳學變化也不 同13。胡衛紅等13采用C02

7、激光輻照釀酒酵母(Saccharomycescereisiae)AS2.1189 篩選到乙醇產量有較大提高的變異株。鮑淑蘭 14以啤酒酵母 (Saccharomycescer- evesea為材料，用He- Ne激光進行照射，發現隨著照射時間的延長，致死率和 突變率均明顯增加，同時在選擇培養基上篩選出多種氨基酸突變型。激光作為一種育種方法， 具有操作簡單、 使用安全等優點， 近年來應用于微 生物育種中取得不少進展。1.5 微波微波輻射屬于一種低能電磁輻射， 具有較強生物效應的頻率范圍在300MHz300GHz,對生物體具有熱效應和非熱效應。其熱效應是指它能引起生 物體局部溫度上升。從而引起生理

8、生化反應 ;非熱效應指在微波作用下，生物體 會產生非溫度關聯的各種生理生化反應。 在這兩種效應的綜合作用下, 生物體會 產生一系列突變效應 15,16。因而,微波也被用于多個領域的誘變育種,如農作物 育種、禽獸育種和工業微生物育種, 并取得了一定成果。 這方面的工作賈紅華等 17和雷肇祖等 18有所報道。1.6 航天育種 航天育種,也稱空間誘變育種,是利用高空氣球、返回式衛星、飛船等航天 器將作物種子、組織、器官或生命個體搭載到宇宙空間, 利用宇宙空間特殊的 環境使生物基因產生變異, 再返回地面進行選育, 培育新品種、 新材料的作物育 種新技術。 空間環境因素主要有微重力, 空間輻射, 以及其

9、它誘變因素如交變磁 場,超真空環境等, 這些因素交互作用導致生物系統遺傳物的損傷, 使生物發生 諸如突變、染色體畸變、細胞失活、發育異常等。我國在這方面取得不少進展, 自1987年以來先后 9次利用返回式衛星, 4次利 用高空氣球搭載了 70多種植物, 500多個品種的 40多公斤種子,涉及到糧食、棉 花、油料、蔬菜、瓜果、花卉等作物,經國內 20多個省、市、區的 50多個研究單 位育種工作者的地面種植試驗,育成了高產、穩產、優質、多抗的青椒、番茄、 水稻、小麥、蓮子等作物新品種、新品系,從中還獲得了一些有可能對產量和品 質等經濟性狀有突破影響的罕見突變 19。航天育種較其它育種方法特殊， 是

10、航天技術與微生物育種技術的有機結合， 技術含量高， 成本高，個體研究者或一般研究單位都難以實現， 只能與航天技術 相結合，由國家來完成。2 化學誘變與物理誘變相比， 化學誘變在某種程度上應用更為廣泛， 是指利用一些化學 物質提高生物的自然突變率， 這些化學物質就叫做化學誘變劑?；瘜W誘變可操 作性強，簡單易行；特異性較強，能誘變定位到DNA上的某些堿基;后代較易穩定 遺傳，一般到F3代就可穩定；應用于遺傳標記，是細胞融合技術的基礎?；瘜W誘變劑主要包括 4類，他們的特點、機理和應用如下 :2.1 烷化劑烷化劑能與一個或幾個核酸堿基反應，引起 DNA 復制時堿基配對的轉換而 發生遺傳變異， 常用的烷

11、化劑有甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、乙烯亞胺、硫酸二 乙酯等。甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulphonate EMS)是最常用的烷化劑，誘變率很 高。它誘導的突變株大多數是點突變，首先是鳥嘌呤的06位置被烷基化，在DNA 的復制過程中，烷基化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對，導致堿基的替換，即 G:C 變 為A:T20。常用濃度為0.050.5mol/L,作用時間560min。該物質具有強烈致癌 性和揮發性，可用 5%硫代硫酸鈉作為終止劑和解毒劑。N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)是一種超誘變劑，應用廣泛，但有一定 毒性，操作時應該注意。在堿性條件下，NTG會形成重氮甲烷(CH

12、2N2),它是引起致死和突變的主要原因。它的效應很可能是 CH2N2對DNA的烷化作用引起的 。周希貴等21用NTG對多粘類芽胞桿菌AS1.541進行誘變，獲得一株粘桿菌素 發酵單位比出發菌株提高 105%的菌株。硫酸二乙酯 ( DMS) 也很常用， 但由于毒性太強， 目前很少使用。 乙烯亞胺， 生產的較少，很難買到。使用濃度 0.0001%0.1%，高度致癌性，使用時需要使 用緩沖液配置。2.2 堿基類似物堿基類似物分子結構類似天然堿基，可以摻入到 DNA分子中導致DNA復制 時產生錯配，mRNA轉錄紊亂，功能蛋白重組，表型改變。該類物質毒性相對較小，但負誘變率很高，往往不易得到好的突變體。

13、主要有 5- 氟尿嘧啶 ( 5- FU)、5- 溴尿嘧啶( 5- BU) 、6- 氯嘌呤等。程世清等 22用5- BU 對產色素菌 (分枝桿菌 T17- 2- 39) 細胞進行誘變，生物量平均提高 22.5%。2.3 無機化合物誘變效果一般，危險性較小。常用的有氯化鋰，白色結晶，使用時配成0.1%0.5%的溶液，或者可以直接加到誘變固體培養基中，作用時間為 30mi n 2d。亞硝酸易分解， 所以現配現用。 常用亞硝酸鈉和鹽酸制取， 將亞硝酸鈉配成0.010.1mol/L的濃度，使用時加入等濃度等體積的鹽酸即可。2.4 其他鹽酸羥胺，一種還原劑，作用于C上，使G- C變為A- T。也較常用，使

14、用濃 度為0.1%0.5%，作用時間60min2h。此外，誘變時將兩種或多種誘變因子復 合使用，或者重復使用同一種誘變因子，效果更佳。顧正華等23以谷氨酸棒桿菌ATCC- 13761為出發菌株，經DMS和NTG多次誘變處理，獲得一株L-組氨酸 產生菌。常翠賢24等以產纖溶酶的根霉丫為出發菌株，通過亞硝基胍、紫外復合誘變， 得到一株高產突變株C6,其產酶活性是出發菌株的4.73倍o杜娟25等以一株具有 較高纖維素酶活性的野生菌株-灰綠曲霉XC9為出發菌株，經氯化鋰、紫外、甲 基磺酸乙酯等多重誘變處理，獲得了抗葡萄糖阻遏的突變株，其 CMC 酶活與出 發菌株相比提高了 2倍左右。3 結束語隨著遺傳

15、學和分子生物學領域的飛速發展， 許多新型復雜的技術被應用于菌 種選育，如原生質體融合育種技術和基因工程育種技術等， 但是誘變育種技術 仍是提供菌株生產能力的重要有效手段。 它獲得的正突變率相對較高， 可以得到 多種優良突變體和新的有益基因類型。 另一方面， 誘變育種存在一定的盲目性和 隨機性，在實際應用中， 研究者應根據出發菌株及實驗室條件等具體情況來選擇 合適的誘變方法。參考文獻1 Madigan , M.T（美）,MartinkoJ.M（美）,Parker, J.（美）.微生物生物學M.北京:科學出版社,2001:390.2 曹友聲，劉仲敏 .現代工業微生物學 M. 長沙:湖南科學技術出版

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