1、制劑無(wú)菌檢查及微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證及驗(yàn)證結(jié)果的技術(shù)評(píng)價(jià) 制劑無(wú)菌檢查及微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證及驗(yàn)證結(jié)果的技術(shù)評(píng)價(jià) 錢維清 （上海市食品藥品檢驗(yàn)所 7>201203 ） 擇要： 本文從為什么必須開(kāi)展制劑無(wú)菌檢查、微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)出發(fā)（why ），說(shuō)明了開(kāi) 展驗(yàn)證的思路和程序、驗(yàn)證的重點(diǎn)（what ）、如何驗(yàn)證（how ）、什么時(shí)候驗(yàn)證（when ），及怎樣對(duì) 驗(yàn)證結(jié)果和驗(yàn)證報(bào)告進(jìn)行技術(shù)評(píng)價(jià)等問(wèn)題。 關(guān)鍵詞：無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證；微生物限度檢查方法驗(yàn)證；驗(yàn)證結(jié)果的技術(shù)評(píng)價(jià) 2005 年版藥典無(wú)菌檢查法和微生物限度檢查法的最重大增訂是要求對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn) 證，及對(duì)驗(yàn)證方法給出了

2、系統(tǒng)的規(guī)定。 這是我國(guó)藥品微生物學(xué)檢查方法與先進(jìn)國(guó)家藥典接 軌、符合國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求協(xié)調(diào)會(huì)（ICH ）的要求、邁向科學(xué)化、合理化的一個(gè)重 要標(biāo)志，也是促進(jìn)我國(guó)藥品微生物學(xué)檢查標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)的重要途徑。為了確保開(kāi)展微生物學(xué)檢 驗(yàn)方法的驗(yàn)證，國(guó)家局、藥典會(huì)、中檢所都先后發(fā)布了要求執(zhí)行驗(yàn)證的相關(guān)法規(guī)和文件1 一、驗(yàn)證的必要性和意義（Why ） 1、隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的鑒別、有關(guān)物質(zhì)、含量測(cè)定等項(xiàng)的檢測(cè) 方法都不斷地在精密度、準(zhǔn)確度上逐步提高。但 2005 年版以前的藥典對(duì)藥品微生物污染檢 查方法的準(zhǔn)確性、可靠性基本無(wú)要求，造成長(zhǎng)期來(lái)在藥品生產(chǎn)工藝、藥品檢驗(yàn)、藥品技術(shù)審 評(píng)中對(duì)

3、與人民用藥安全有效密切相關(guān)的微生物污染監(jiān)控、監(jiān)測(cè)方法缺乏警惕和衡量的標(biāo)準(zhǔn)， 與先進(jìn)國(guó)家的藥典和藥品技術(shù)審評(píng)要求脫節(jié)。 2 、對(duì)所用的檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證，是分析測(cè)量科學(xué)的基本要求，是各種法規(guī)遵循工作的基 礎(chǔ)。藥品微生物學(xué)的檢查作為整個(gè)藥品質(zhì)量體系中的一個(gè)環(huán)節(jié)，也應(yīng)與化學(xué)分析的嚴(yán)謹(jǐn)要求 靠攏，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。 3、通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，可對(duì)每種藥品的具體檢驗(yàn)方法的可靠性及結(jié)果的準(zhǔn)確性予以確認(rèn)，從 而形成標(biāo)準(zhǔn)化的操作。這是促進(jìn)藥品無(wú)菌、微生物限度檢查走向標(biāo)準(zhǔn)化的重要途徑。 4 、通過(guò)對(duì)同品種但不同批號(hào)或不同生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品的微生物學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)比較，可以發(fā)現(xiàn) 產(chǎn)品所用原料質(zhì)量或工藝流程中是否存在污染抑菌物質(zhì)

4、的問(wèn)題，具有藥品質(zhì)量控制的意義。 二、開(kāi)展驗(yàn)證的思路和程序 1 首先了解供試品是否有抑菌性、抑什么菌。 2 考慮和選擇出適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ蚪档凸┰嚻返囊志浴?3 用實(shí)驗(yàn)證明你所用的方法已消除抑菌性 能使人工加入的各種試驗(yàn)菌生長(zhǎng)良好。特別 是能滿足對(duì)產(chǎn)品最敏感菌的生長(zhǎng)。 4 將所作實(shí)驗(yàn)記錄在案 即為確認(rèn)該供試品在該檢驗(yàn)量，在該檢驗(yàn)條件下已充分消除 抑菌性，能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果正確可靠的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告。 以上4 點(diǎn)思路和程序也是對(duì)驗(yàn)證報(bào)告進(jìn)行技術(shù)評(píng)價(jià)和審核時(shí)必須注意和考察的 4 點(diǎn)。 三、驗(yàn)證的重點(diǎn)是什么？（what ） 無(wú)菌、微生物限度檢查的驗(yàn)證試驗(yàn)可概括描述為：在采用的檢驗(yàn)方法和過(guò)程中，通過(guò)分 別

5、加入規(guī)定量的代表性微生物，以試驗(yàn)供試品是否在規(guī)定的檢驗(yàn)量、在所采用的檢驗(yàn)條件下 1 無(wú)抑菌性，或已充分消除了抑菌性（供試品本身的以及操作系統(tǒng)中可能對(duì)微生物生長(zhǎng)有影響 的各種因素），并且所用方法對(duì)微生物生長(zhǎng)無(wú)不良影響，從而確認(rèn)檢驗(yàn)方法的有效性，保證 檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。因此，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明，保證其對(duì)結(jié) 果判斷沒(méi)有影響。按樣品的檢驗(yàn)流程，驗(yàn)證的重點(diǎn)環(huán)節(jié)分布如下： 需前處理 驗(yàn)證前處理方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)、檢出的影響。 樣品 有抑菌作用 去除抑菌作用 不需前處理 通過(guò)驗(yàn) 驗(yàn)證抑菌活性去除方法的有效 證實(shí)驗(yàn)判 性及對(duì)污染菌檢出無(wú)影響。 無(wú)抑菌作用 檢驗(yàn) What1 ：驗(yàn)證制成適

6、宜供試液的前處理方法，證明方法對(duì)微生物生長(zhǎng)、檢出無(wú)影響。 What2 ：驗(yàn)證樣品有無(wú)抑菌性、抑什么菌 ？最敏感的菌是那一個(gè)？ 其結(jié)果將直接影響 下續(xù)檢驗(yàn)方法的選擇和操作步驟的進(jìn)行，并是最終所選檢驗(yàn)方法和操作步驟合理性的證明。 What3 ：驗(yàn)證消除樣品抑菌活性的方法，證明方法的有效性及方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)無(wú)影響。 如何選擇合理、適宜、簡(jiǎn)單有效的消除抑菌活性的方法是當(dāng)前驗(yàn)證工作的關(guān)鍵。 驗(yàn)證報(bào)告對(duì)以上 3 個(gè)環(huán)節(jié)的情況是否都有交待；所采用的方法是否科學(xué)、合理、有效， 并且提供了實(shí)驗(yàn)的證明，也是對(duì)驗(yàn)證報(bào)告進(jìn)行技術(shù)評(píng)價(jià)和審核時(shí)必須注意考察的 3 點(diǎn)。 四、怎么驗(yàn)證？（How ） 按藥典對(duì)樣品無(wú)菌檢查的規(guī)

7、定和要求，或是微生物限度檢查的規(guī)定和要求進(jìn)行，對(duì)每一 試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。微生物學(xué)的驗(yàn)證試驗(yàn)一般分 4 個(gè)步驟進(jìn)行： 1、制備驗(yàn)證試驗(yàn)用菌液How1 ： 按藥典無(wú)菌檢查法中培養(yǎng)基靈敏度檢查項(xiàng)中試驗(yàn)用菌液制備的方法將規(guī)定需用的試驗(yàn)菌 分別制成每毫升中含 10100 個(gè)菌（CFU ）的供試菌液。驗(yàn)證報(bào)告中應(yīng)給出各種試驗(yàn)用菌液 的制備和菌液含菌量計(jì)數(shù)的原始記錄。 2 、樣品的前處理方法How2 ： 為達(dá)到制備成均勻的供試液及為后續(xù)采取消除抑菌活性的方法作準(zhǔn)備，將所采取的前處 理方法應(yīng)用和參加到驗(yàn)證試驗(yàn)中，以證明所用處理方法對(duì)各試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)無(wú)影響。 按供試品的性狀選用以下適宜的方法，或幾種方法聯(lián)

8、合使用： 溶解： 驗(yàn)證所用溶液、助溶劑和水浴助溶溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)無(wú)影響。 乳化： 驗(yàn)證所用乳化劑和水浴助溶溫度的有效性、使用量及對(duì)微生物生長(zhǎng)無(wú)影響。 破乳： 驗(yàn)證所用破乳劑的有效性、使用量及對(duì)微生物生長(zhǎng)無(wú)影響。 萃取： 驗(yàn)證有機(jī)相選擇的合理性、有效性及對(duì)微生物生長(zhǎng)無(wú)影響。 2 稀釋： 驗(yàn)證降低供試品相對(duì)抑菌濃度的有效稀釋倍數(shù)。 離心： 驗(yàn)證所用轉(zhuǎn)速、時(shí)間和微生物的分布情況。 驗(yàn)證報(bào)告中應(yīng)有采取某種前處理方法的原因有說(shuō)明，并記錄操作步驟以增加重現(xiàn)性。樣 品如不需要特別的前處理就能制成均勻的供試液，那么這一步驟可省掉，直接進(jìn)入確定樣品 有無(wú)抑菌性的How3 3、確定供試品是否有抑菌性、抑什么菌Ho

9、w3 ： 可通過(guò)查閱臨床藥物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)、文獻(xiàn)資料（特別是雜志“Drug”，每一種新藥上市，都有 專門的綜述）、申報(bào)資料中的藥效學(xué)資料，關(guān)注其對(duì)不同細(xì)菌的 MIC 情況、參考已經(jīng)驗(yàn)證過(guò) 的品種、抗菌藥物可根據(jù)抗菌譜確定其敏感菌、中成藥如果抗菌譜不清楚，至少需選擇一株 細(xì)菌和一株真菌來(lái)試驗(yàn)等方法。也可直接通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定之。 用實(shí)驗(yàn)確定是否具有抑菌性的方法：在規(guī)定量的供試液中加入實(shí)驗(yàn)用微生物 10100 個(gè)， 如微生物生長(zhǎng)良好，即說(shuō)明供試品對(duì)該種微生物無(wú)抑菌活性。如已用藥典規(guī)定的各試驗(yàn)菌試 驗(yàn)，結(jié)果均能生長(zhǎng)良好，說(shuō)明供試品無(wú)抑菌性，可用常規(guī)方法檢驗(yàn)之。 將這些試驗(yàn)記錄在 案就是證明該供試品無(wú)抑菌性的驗(yàn)證試驗(yàn)部分；如加入的微生物不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢，說(shuō) 明供試品有抑菌性，將這些試驗(yàn)記錄在案就是證明該供試品有抑菌性的驗(yàn)證試驗(yàn)部分； 如加入的微生物中有某一種菌最不能生長(zhǎng)或生長(zhǎng)最緩慢，這一種菌就是該樣品的敏感菌。 4 、選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ蛴行Ы档凸┰嚻返囊志钚訦ow4 ： 根據(jù)供試品特性選擇藥典規(guī)定的消除供試品抑菌活性的方法（一種或幾種聯(lián)合），或利 用藥物化學(xué)知識(shí)，尋找出其他合理、有效的方法，特別是有效的中和劑（這是值得鼓勵(lì)的 發(fā)展方向）。并通過(guò)模擬實(shí)驗(yàn)（驗(yàn)證試驗(yàn)）對(duì)消除或降低抑菌活性的效果加以檢驗(yàn)。 無(wú)菌檢查中可采用： 薄膜過(guò)