1、缺氧對(duì)膀胱平滑肌細(xì)胞縫隙連接蛋白表達(dá)的影響         11-01-09 11:42:00     作者：章振保，林浩    編輯：studa20【摘要】  目的 通過(guò)研究膀胱出口部分梗阻及缺氧環(huán)境下膀胱平滑肌細(xì)胞中縫隙連接蛋白表達(dá)的變化，探討不穩(wěn)定膀胱的發(fā)生規(guī)律。方法 建立不穩(wěn)定膀胱大鼠模型、體外正常大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞并造成其細(xì)胞缺氧狀態(tài)；采用RTPCR和Western blot分析膀胱平滑肌細(xì)胞的縫隙連接蛋白的表達(dá)。結(jié)

2、果 不穩(wěn)定膀胱組及缺氧組(15min、30min、1h)膀胱平滑肌細(xì)胞中Cx40、Cx43在mRNA及蛋白水平上均高于模型對(duì)照組及缺氧對(duì)照組(P<0.01)，其中缺氧15min組Cx43的mRNA及蛋白表達(dá)量均較缺氧30min組、缺氧1h組高(P<0.01)。結(jié)論 膀胱出口部分梗阻能引起平滑肌細(xì)胞缺氧與縫隙連接蛋白表達(dá)增多，平滑肌細(xì)胞缺氧也能引起縫隙連接蛋白表達(dá)增加。膀胱出口部分梗阻后導(dǎo)致的不穩(wěn)定膀胱的發(fā)生可能與膀胱平滑肌細(xì)胞缺氧有著密切關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】  平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞缺氧；不穩(wěn)定膀胱；縫隙連接蛋白；膀胱出口梗阻    ABSTRACT

3、: Objective  To study the pathogenesis of unstable bladder with partial bladder outlet obstruction through the experiment based research on connexins in both unstable bladder group and cell hypoxia group. Methods  Unstable bladder rat models were established and smooth muscle cells were cu

4、ltured in vitro. Then cell anoxia was induced. RTPCR and Western blot were used to quantify the connexins. Results  The mRNA levels of Cx40, Cx43 and the Cx43 protein expressed in the smooth muscle cells from the unstable bladder group and cell hypoxia groups were all higher than those in the c

5、ontrol groups (the shamoperation group and normoxia groups) (P<0.01). In the cell hypoxia groups, cells exposed to 15min hypoxia expressed much higher Cx43 than the other two groups (P<0.01). Conclusion  Partial bladder outlet obstruction which leads to unstable bladder might cause cell h

6、ypoxia and the increased expression of connexins. In our study, cell hypoxia also increased the expression of connexins. Therefore, we conclude that cell hypoxia might play a key role in connecting partial bladder outlet obstruction and unstable bladder.    KEY WORDS: smooth muscle ce

7、ll; cell hypoxia; unstable bladder; connexin; bladder outlet obstruction   膀胱出口部分梗阻將導(dǎo)致不穩(wěn)定膀胱的發(fā)生1，其發(fā)病機(jī)制至今未明。在建立的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，膀胱出口部分梗阻能引起膀胱出現(xiàn)三個(gè)期的病理變化，依次為肥大增生期、代償期和失代償期。在肥大增生期間，雖伴隨血管生長(zhǎng)，但膀胱平滑肌細(xì)胞仍存在缺氧2。研究表明，膀胱出口部分梗阻后不穩(wěn)定膀胱的發(fā)生，與縫隙連接蛋白具有密切的關(guān)系34。縫隙連接蛋白作為一種獨(dú)特的蛋白通道，通過(guò)在相鄰細(xì)胞間傳遞小分子第二信使、離子和代謝產(chǎn)物等，產(chǎn)生直接的電偶聯(lián)和化學(xué)偶聯(lián)效

8、應(yīng)5，與不穩(wěn)定膀胱的發(fā)生密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在建立膀胱出口部分梗阻大鼠模型基礎(chǔ)上取模型大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，同時(shí)，將正常大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)造成細(xì)胞缺氧模型，通過(guò)RTPCR和Western blot等實(shí)驗(yàn)方法，在細(xì)胞水平檢測(cè)縫隙連接蛋白的變化，探討膀胱出口部分梗阻后發(fā)生的細(xì)胞缺氧與不穩(wěn)定膀胱發(fā)生的關(guān)系。    1  材料與方法    1.1  實(shí)驗(yàn)對(duì)象  雌性Wistar大鼠60只，購(gòu)自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重200250g，隨機(jī)分為模型組30只，模型對(duì)照組10只，缺氧組10只

9、，缺氧對(duì)照組10只。模型組大鼠建立膀胱出口梗阻(BOO)模型后行充盈性膀胱測(cè)壓3，確定不穩(wěn)定膀胱大鼠17只，模型對(duì)照組僅行尿道分離術(shù)而不結(jié)扎；缺氧組及缺氧對(duì)照組大鼠未做處理。模型組膀胱測(cè)壓后抗生素腹腔注射3d，斷頸法處死各組所有大鼠，于無(wú)菌環(huán)境下切除膀胱，分離漿膜層與黏膜層后，無(wú)菌生理鹽水沖洗干凈，采用組織塊貼壁法6及差速貼壁法7分離培養(yǎng)膀胱平滑肌細(xì)胞，使用含150ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2環(huán)境下培養(yǎng)。    1.2  細(xì)胞鑒定  第2代細(xì)胞行細(xì)胞鑒定后，第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。缺氧組細(xì)胞隨機(jī)分為缺氧15min

10、組、缺氧30min組和缺氧1h組，缺氧對(duì)照組細(xì)胞隨機(jī)分為15min組、30min組和1h組。    1.3  主要試劑  抗SMactin抗體，購(gòu)自博士德公司；總RNA提取試劑盒、一鏈合成試劑盒及PCR試劑盒均購(gòu)自加拿大BBI公司；Cx40、Cx43及內(nèi)參18S引物由上海基康生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成；抗Cx43多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)自Sigma公司；缺氧液按比例配制8(mmol/L：NaCl3，KCl 12，MgCl2 0.4，CaCl2H2O 0.9, HEPES 4，乳酸鈉20，蒸餾水500m

11、L)后，調(diào)pH值至6.2，抽濾除菌后4保存。    1.4  細(xì)胞鑒定  使用特異性抗SMactin抗體(工作濃度1100，購(gòu)自博士德公司)，將傳代細(xì)胞懸液滴于蓋玻片上，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%90%融合時(shí)取出，40g/L多聚甲醛固定20min后，Triton破膜20min，20mL/L小牛血清封閉30min，抗SMactin抗體4孵育過(guò)夜，生物素標(biāo)記二抗為羊抗小鼠IgG(工作濃度1200，購(gòu)自Sigma公司)室溫孵育1h，ABC(avidinbiotin complex 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Vector Laboratories公司)試劑反應(yīng)30min，

12、3，3二氨基聯(lián)苯胺(3 3diaminobenzidine, DAB)顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，空白對(duì)照組用1×PBS取代一抗，余操作相同。    1.5  建立細(xì)胞缺氧模型  缺氧組細(xì)胞分為缺氧15min組、缺氧30min組、缺氧1h組，將各組細(xì)胞培養(yǎng)液倒干凈后，無(wú)菌PBS沖洗三遍后將培養(yǎng)瓶烘干，加入提前用高純氮?dú)怙柡?0min的缺氧液，根據(jù)培養(yǎng)容器大小繼續(xù)充入一定量高純氮?dú)庖则?qū)趕容器中剩余的空氣，迅速密閉后放入缺氧盒中，置37、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15min、30min、1h。缺氧對(duì)照組細(xì)胞以培養(yǎng)基代替缺氧液

13、，換液后在37、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2環(huán)境下培養(yǎng)15min、30min、1h。    1.6  RTPCR檢測(cè)Cx40和Cx43  按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的步驟提取總RNA，合成一鏈后進(jìn)行PCR反應(yīng)。建立25L擴(kuò)增反應(yīng)體系：cDNA 1L、10×Master Mix 12.5L、ddH2O 10.5L、上下游引物各0.5L。PCR反應(yīng)條件為94預(yù)熱5min，94變性30s，60退火30s，72延伸1min，40個(gè)循環(huán)后72最后延伸6min。反應(yīng)產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳，并掃描入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均吸光度值(Cx/18S

14、)表示。    1.7  Western blot檢測(cè)Cx43  提取細(xì)胞總蛋白后，將40g蛋白經(jīng)15g/L十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠(SDSPAGE)電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，50g/L脫脂奶封閉30min，1100一抗4孵育過(guò)夜，1500二抗室溫孵育1h，ABC(avidinbiotin complex 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Vector Laboratories公司)試劑反應(yīng)30min，用底物4氯1萘酚顯色。顯色結(jié)果吸光度掃描進(jìn)電腦后，采用分析軟件Quantity One進(jìn)行分析。    1.8  統(tǒng)計(jì)

15、學(xué)方法  實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，模型組與模型對(duì)照組、缺氧組與缺氧對(duì)照組兩組間對(duì)比采用配對(duì)t檢驗(yàn)，缺氧組與缺氧對(duì)照組間比較用一元方差分析，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)    果    2.1  RTPCR檢測(cè)到平滑肌細(xì)胞中Cx40、Cx43的表達(dá)  結(jié)果顯示Cx40、Cx43在4組細(xì)胞中均有表達(dá)。在凝膠成像系統(tǒng)中與18S比較，Cx40、Cx43在不穩(wěn)定膀胱組中的表達(dá)較模型對(duì)照組有明顯增加(圖1)；在缺氧組1

16、5min、缺氧組30min、缺氧組1h中的表達(dá)亦較缺氧對(duì)照組15min組、30min組、1h組明顯增加(圖2)。各組間兩者相比較差異具有顯著性(P<0.01)。另外，Cx43在缺氧15min組的表達(dá)比缺氧30min組、缺氧1h組強(qiáng)，兩者比較差異具有顯著性(P<0.01)，缺氧30min組與缺氧1h組間差異無(wú)顯著性。    2.2  Western blot檢測(cè)到的平滑肌細(xì)胞Cx43蛋白的表達(dá)  Cx43蛋白在所有細(xì)胞組中均有表達(dá)。不穩(wěn)定膀胱組較模型對(duì)照組表達(dá)明顯增加(圖3)；缺氧組15min、缺氧組30min、缺氧組1h較缺氧對(duì)照組

17、表達(dá)量亦明顯增加(P<0.01)，缺氧15min時(shí)，Cx43表達(dá)量較缺氧30min、缺氧1h要高(P<0.01)，缺氧30min組與缺氧1h組之間差異亦無(wú)顯著性(圖4)，這些變化均與Cx43在mRNA水平上的變化一致。     11-01-09 11:42:00     作者：章振保，林浩    編輯：studa20    3  討    論    本實(shí)驗(yàn)通過(guò)造成不

18、穩(wěn)定膀胱動(dòng)物模型，取模型大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證了膀胱出口部分梗阻引起的不穩(wěn)定膀胱平滑肌細(xì)胞中，縫隙連接蛋白表達(dá)較對(duì)照組細(xì)胞顯著增加。這與之前組織學(xué)上的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本一致3。梗阻引起不穩(wěn)定膀胱發(fā)生的病理機(jī)制未明。近年研究表明，縫隙連接蛋白表達(dá)的增加可能是引起膀胱不穩(wěn)定收縮的重要因素。縫隙連接蛋白是一種獨(dú)特的通道。它通過(guò)在相鄰細(xì)胞間傳遞小分子第二信使、離子和代謝產(chǎn)物等，產(chǎn)生直接的電偶聯(lián)和化學(xué)偶聯(lián)效應(yīng)5。正常膀胱平滑肌細(xì)胞之間存在大量中間連接，而少見(jiàn)縫隙連接，在膀胱出口部分梗阻導(dǎo)致的不穩(wěn)定膀胱中，中間連接明顯減少而被大量縫隙連接取代9，但梗阻后如何引起縫隙連接蛋白表

19、達(dá)的變化尚未明了10。    目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到將細(xì)胞缺氧作為聯(lián)系膀胱出口部分梗阻與縫隙連接蛋白表達(dá)增加的病理機(jī)制的相關(guān)研究。NAAMA等11研究發(fā)現(xiàn)，新生大鼠心肌細(xì)胞在缺氧環(huán)境下出現(xiàn)縫隙連接蛋白重構(gòu)，并推測(cè)其與心律失常發(fā)生具有一定聯(lián)系。LI等12發(fā)現(xiàn)缺氧引起Cx43發(fā)生明顯的去磷酸化。CHEN等13也發(fā)現(xiàn)，在慢性缺氧條件下，大鼠的頸動(dòng)脈小體和巖神經(jīng)節(jié)中Cx43的表達(dá)亦相應(yīng)增加。膀胱出口部分梗阻持續(xù)一段時(shí)間后，膀胱組織出現(xiàn)代償性肥大，細(xì)胞增生，雖然伴隨血管發(fā)生，但由于流出道阻力增大和殘余尿量增加，使得膀胱逼尿肌壓力升高并超過(guò)毛細(xì)血管壓力，最終導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞缺血缺

20、氧14。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)缺氧后與梗阻后膀胱平滑肌細(xì)胞縫隙連接蛋白表達(dá)均較缺氧對(duì)照組及模型對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)增加(P<0.01)。有報(bào)道稱(chēng)，通過(guò)結(jié)扎尿道建立的鼠膀胱出口部分梗阻模型中，Cx43的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平在結(jié)扎后79h達(dá)到最大值4。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中，將正常環(huán)境下培養(yǎng)的膀胱平滑肌細(xì)胞通過(guò)換入缺氧液并灌注高純氮?dú)庠斐杉?xì)胞缺氧模型，觀察膀胱平滑肌細(xì)胞在不同缺氧條件下(15min、30min、1h)縫隙連接蛋白表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膀胱平滑肌細(xì)胞缺氧后能引起細(xì)胞縫隙連接蛋白表達(dá)的增加，并且在平滑肌細(xì)胞缺氧發(fā)生早期(15min)，縫隙連接蛋白表達(dá)已很活躍。雖然隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)(30

21、min、1h)，縫隙連接蛋白表達(dá)量有所下降，但仍較缺氧對(duì)照組細(xì)胞的表達(dá)有明顯增加(P<0.01)，符合梗阻后膀胱平滑肌處于缺氧環(huán)境下發(fā)生不穩(wěn)定收縮的病理變化過(guò)程。以此為據(jù)，我們推測(cè)膀胱出口部分梗阻后引起的膀胱平滑肌細(xì)胞缺氧是導(dǎo)致縫隙連接蛋白表達(dá)增加的重要因素。【參考文獻(xiàn)】  1CHRIST GJ, DAY NS, DAY M, et al. Increased connexin43mediated intercellular communication in a rat model of bladder overactivity in vivo J. Am J Physiol

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