1、942008No 122Se ri a lNo 1199Chi na B rew i ng Food Safety &Detecti on以高濃度葡萄糖為碳源的L 2蘇氨酸發酵工藝研究馮志彬1,趙彥宏1,王東陽2,程顯好1,繆靜1,丁涓1(11魯東大學生命科學學院,山東煙臺264025;21鄄城菱花味精股份公司,山東鄄城272000摘要:以L 2蘇氨酸生產菌T RFC 為供試菌株,研究了高葡萄糖濃度下各種生長因子和培養條件對L 2蘇氨酸發酵的影響。結果表明,脯氨酸可以解除高濃度葡萄糖對L 2蘇氨酸發酵的抑制作用,生物素可以提高L 2蘇氨酸生產菌的細胞得率及L 2蘇氨酸的產量,利用搖瓶發

2、酵確定最佳用量分別為60mg/L 和120g/L;控制pH710和采用控制溶氧的脈沖補料方式L 2蘇氨酸產量得到進一步的提高。在最優條件下,利用10L 發酵罐發酵38h,L 2蘇氨酸產量可達11012g/L,糖酸轉化率為4517%。關鍵詞:高葡萄糖濃度;L 2蘇氨酸;脯氨酸;補料方式中圖分類號:TQ 922文獻標識碼:A 文章編號:0254-5071(200822-0094-03Study on L 2threon i n e fer ment ati on under hi gh glucose concentrati onFE NG Zhibin 1,Z HAO Yanhong 1,WAN

3、G Dongyang 2,CHE NG Xianhao 1,M I U J ing 1,D ing Juan 1(1.College of L ife Science,Ludong U niversity,Yantai 264025,China;2.Shandong JuanehengL inghua Cour m et Co .,L td .,Juaneheng 272000,China Abstract:Taking L 2threonine Pr oducing Strain T RFC as bacterial strains ,the effect of the growth fac

4、tors and culture conditi ons on the L 2threonine fer men 2tati on under high glucose concentration was studied 1The p r oline could release from restrain of high glucose concentration t o L 2threonine fer mentation,thebi otin could i m p r ove the cell yield and L 2threonine yield,the opti m al dosa

5、ge were 60mg/L and 120g/L res pectively in shaking flask fer mentation;The L 2threonine yield could i mprove when pH was 710and adop ted pulse feed mode of contr olling diss olved oxygen 1Under opti m al conditions,fer mented 38h in 10L fer ment or,the L 2threonine yield could reach 11012g/L,glucose

6、 acid invert ratio was 4517%1Key words:high glucose concentration;L -threonine;p r oline;feed mode收稿日期:2008209210作者簡介:馮志彬(19772,男,山東濟寧人,講師,主要從事發酵工程方面的研究工作。L 2蘇氨酸是一種必需氨基酸,作為添加劑廣泛應用于飼料工業、保健食品和醫藥工業。在大多數植物蛋白飼料中,蘇氨酸是第2或第3限制性氨基酸,是重要的營養強化劑。L 2蘇氨酸用量伴隨著賴氨酸用量的增加而增加,一般情況下二者比例為21。在食品、飼料中添加少量的L 2蘇氨酸和L 2賴氨酸,可顯著提高

7、蛋白質的有效利用率。在醫藥上,L 2蘇氨酸用于配制復合氨基酸輸液,可用作代謝改善劑,對抗潰瘍、防輻射、催眠、鎮靜等有較好效果1。L 2蘇氨酸的生產成本主要依賴于培養基的成本,而碳源和氮源則又代表了培養基的主要成本,在同等發酵條件下使用廉價原料作為碳源和氮源將有效提高在發酵工藝日益成熟的生物行業的競爭性。葡萄糖是最為常用的生物碳源,制備工藝成熟,價格低廉,且能夠被絕大多數為生物利用,因而在發酵行業廣泛應用。前期工作發現較高濃度的葡萄糖(70g/L 對L 2蘇氨酸生產菌的生長有抑制作用2。通過在發酵培養基中添加脯氨酸和生物素等生長因子和改善培養條件等措施,在高糖濃度下L 2蘇氨酸發酵取得了較好的效

8、果。1材料與方法111菌種及培養基參照參考文獻2的配方配制。112培養方法種子培養:吸取適量無菌生理鹽水于1支活化斜面中,將所有菌懸液全部接入5L 種子罐中,攪拌轉速為300r/min 700r/min,通過自動流加氨水控制pH 值為710,培養溫度為37。10L 罐發酵:按1%接種量將種子液接入10L 發酵罐中,初始通風量2L /min,攪拌轉速500r/min 800r/min,通過自動流加氨水控制pH 值為710,培養溫度37,以泡敵消泡,發酵到一定時間流加補料液。發酵過程中每隔一定時間取樣進行各項參數測定。113分析方法pH 值:采用酸度計測定。菌體生長:吸取樣品菌液,用蒸餾水稀釋一定

9、倍數,以蒸餾水作為空白對照,采用752分光光度計于1c m 光程測定OD 600n m 。葡萄糖:S BA 240C 生物傳感分析儀測定4。L 2蘇氨酸含量:采用Elite 2AAA 氨基酸分析系統測定。2結果與分析211高葡萄糖濃度下脯氨酸對L 2蘇氨酸發酵的影響實驗表明,較高濃度的葡萄糖對L 2蘇氨酸的發酵有抑制作用;而在較低的初糖濃度(40g/L 時,菌體中期增殖無力,發酵結束時生物量偏低。國外研究者發現脯氨酸對L 2蘇氨酸生產菌耐受高濃度葡萄糖(70g/L 有一定作用3。采用80g/L 的葡萄糖作為碳源,在搖瓶食品安全與檢測中國釀造2008年第22期總第199期95中添加0mg /L

10、、20mg/L 、40mg/L 、60mg/L 、80mg/L 的L 2脯氨酸,考察對L 2蘇氨酸發酵的影響,發酵48h,結果見圖1。 圖1脯氨酸添加量對L 2蘇氨酸發酵的影響F i gure 11Effect of p r o li ne on L 2threoni ne fe r m enta ti on由圖1可知,菌體生長量和L 2蘇氨酸產量隨脯氨酸添加量的增大而增加。當脯氨酸濃度為0mg/L 60mg/L 時,L 2蘇氨酸產量及菌體生長量和脯氨酸含量成正線性相關;當脯氨酸濃度>60mg/L 時,蘇氨酸產量和菌體生長量增加不明顯,故脯氨酸添加量選擇為60mg/L 。212添加生物素

11、對L 2蘇氨酸發酵的影響磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸都是L 2蘇氨酸生產菌合成代謝途徑中的中間代謝產物,草酰乙酸是天冬氨酸族氨基酸的前體物,由磷酸烯醇式丙酮酸通過羧化反應得來。在羧化反應中,生物素是原料物質和受體分子間羧基轉移的載體。LEE M H 等4報道生物素可以明顯增加L 2蘇氨酸生產菌的生物量,從而相應提高L 2蘇氨酸的產量,在搖瓶中添加不同濃度的生物素(0g/L 、30g/L 、60g/L 、90g/L 、120g/L 培養48h,考察對L 2蘇氨酸發酵的影響,結果見圖2。 圖2生物素對L 2蘇氨酸發酵的影響Fi gure 21Effec t of bi o ti n on L 2th

12、reoni ne fe r m enta ti o n高的L 2蘇氨酸產量的獲得必須有足夠量的生產細胞,由于高濃度葡萄糖的限制,菌體生長量偏低。由圖2可知,隨著生物素添加量的增加,L 2蘇氨酸生產菌的生長量也線性增加,在120g /L 時取得最大值(OD 600nm =01981,這和文獻報道相一致。但當生物素濃度>90g /L 時,菌體生長量雖然增加,蘇氨酸產量反而降低。合理的添加量應為90g /L 。213pH 值對L 2蘇氨酸發酵的影響pH 值是微生物生長和產物合成中非常重要的狀態參數,是代謝活動的綜合指標,在發酵過程中應及時監控,使它處于生產的最佳狀態5。發酵過程中維持不同的pH

13、 值,在10L 罐上補料分批發酵,考察L 2蘇氨酸發酵的影響,結果見表1。表1pH 值對L 2蘇氨酸發酵的影響Tabl e 11Effec t of pH on L 2threoni ne fe r m enta ti o npH 值吸光度值(OD 600n m L 2蘇氨酸/(g L -1發酵時間/h 610019987619406131110280123661711297961736710112639918367121119089113771511001781640pH 值對許多酶的催化過程和許多細胞之間的特性傳遞過程有很大的影響,pH 值的變化能改變體系的酶環境和營養物質的代謝流,使得誘

14、導物和生長因子在活性和非活性之間變化。由表1可見,pH 值對L 2蘇氨酸影響很大:pH 值控制為613以下時,菌濃度相對較低,葡萄糖消耗速率相對較低,最終的L 2蘇氨酸產量<80g/L 。pH 值控制為712時,菌體生長較好,殘糖較低(最終殘糖只有5g/L 左右,L 2蘇氨酸的生產速率發酵前期較快,而后變得緩慢,最終產量為8911g/L,當pH 值>712時,對菌體生長和產酸有明顯地抑制作用。pH 值控制為710時,菌體前期生長良好,32h 后菌濃度略有下降,葡萄糖的消耗速率相對較高L 2蘇氨酸的產量相對較高(最終達9918g/L 。這可能是中性條件有利于菌體生長。214流加方式對

15、L 2蘇氨酸發酵的影響流加操作是指在培養過程中不斷向反應器中加入培養基,但并不同時取出培養液的方法。根據L 2蘇氨酸實際發酵過程的特點,按照反饋參數和流加方式的不同,考察恒速流加、恒殘糖流加、控制溶氧的脈沖流加等流加方式對L 2蘇氨酸發酵的影響,結果見圖3。962008No 122Se ri a lNo 1199Chi na B rew i ng Food Safety &Detection 圖3補料方式對菌體OD 600nm 值(A 、L 2蘇氨酸產量(B 的影響Fi gure 31Effec t of feed mode on ce ll OD 600nm and L -threo

16、ni nep r oducti o n恒速流加即補料液在整個發酵過程中一直保持恒定流速不變,此種補料方式葡萄糖在發酵前期和穩定期后期相對過量,在主產酸期不足,受葡萄糖濃度的影響,發酵前期菌體生長較快,活力衰退較快,產酸水平不高。恒殘糖流加是根據上一時間間隔的耗糖量預測下一時刻的耗糖量,從而將流速調至合適值,保持糖濃度的恒定。但由于在線測量的不易實現,葡萄糖濃度需離線測量,只能預測補糖,補入的糖量可能不合適,菌體生長和產酸并不能像預測一樣穩定,整個發酵過程菌體生長較慢,但產酸高于恒速補料。控制溶氧的脈沖流加,根據溶氧值隨時控制流加速率,OD 600n m 值上升表明糖量不足,應增加補料速率,使溶

17、氧值保持在合適范圍內。此方式補糖迅速,過程參數控制較好,且脈沖補料是一種振蕩補料方式,可引起菌體共諧,基質內營養物質更易為菌體充分利用。在此方式下菌體生長和產酸均取得了良好的效果,發酵38h,菌體OD 600n m 值最高為11293,產酸可達10619g/L 。215典型過程發酵曲線以葡萄糖為碳源,在最優發酵條件下測定了10L 自動發酵罐L 2蘇氨酸補料分批發酵過程中菌體濃度、殘糖、L 2蘇氨酸產酸等過程參數,結果見圖4。從圖4可以看出,0h 5h 為菌體生長的延滯期,此時菌體利用基質速度較慢,且主要用于長菌,基本不產酸;5h 20h 為菌體對數生長期,耗糖速率最快,并急劇產酸,此階段產酸增

18、速最高;20h 36h 菌體進入穩定期,在此階段,菌體耗糖速率較快,蘇氨酸大量合成,36h 后為菌體衰退期,這時菌體耗糖速率減慢。發酵36h,L 2蘇氨酸產量為11012g/L,轉化率為4517%。圖4分批補料發酵過程曲線Fi gure 41Ti m e -course of fed -ba tch fe r m enta ti o n3結論L 2蘇氨酸生產菌在高葡萄糖濃度(7%下生長受到抑制,菌體生長量不足,產酸較低,通過在發酵培養基中添加脯氨酸解除了高葡萄糖濃度對L 2蘇氨酸發酵的抑制作用;進一步添加生物素提高了菌體的生長量。在10L 發酵罐上采用補料分批發酵考察了pH 值及補料方式對L 2蘇氨酸發酵的影響,結果表明,在pH 值為710、采用溶氧控制的脈沖流加方式進行補料時發酵結果較好。參考文獻:1賈冬舒1蘇氨酸市場現狀及發展前景J 1飼料廣角,2006(1:2822912馮志彬,孫玉華,陳寧,等1碳源對L 2蘇氨酸發酵的研究J 1食品與發酵工業,2006,32(8:1521713S ONG K H,LEE H H,HY UN H H 1Characterizati on of salt 2t olerant mu 2tant f or enhance ment of L 2threonine pr oducti o