1、    Losartan對神經肽Y誘導血管平滑肌細胞增殖的逆轉作用        摘要目的：觀察神經肽Y（NPY）與血管緊張素受體拮抗劑losartan對體外培養的血管平滑肌細胞（VSMC）中PCNA、PDGF、c-myc癌基因表達的影響，從分子生物學的角度探討NPY在高血壓、動脈粥樣硬化發生中的作用和losartan的逆轉作用。方法：應用熒光免疫組化定量技術(ACAS570共聚焦激光掃描顯微細胞儀)。結果：NPY刺激VSMC增殖，使其PCNA、PDGF和c-myc癌基因的表

2、達明顯高于對照組；losartan則可逆轉NPY對VSMC增殖的刺激作用，使PCNA、PDGF和c-myc癌基因表達的平均熒光值降低。結論：NPY促進VSMC的增殖，其作用與高血壓的發生有關；而losartan對高血壓的治療作用可能與拮抗NPY對VSMC增殖的刺激作用有關。主題詞神經肽Y； 血管緊張素； 受體， 血管緊張素； 肌， 平滑， 血管中分類號 Q 253文獻標識碼 A文章編號1000-4718(2000)03-0211-03 The stimulating effects of neuropeptide Y on cultured arterial smooth muscle cel

3、l proliferation and losartan treatmentHUANG Shao-hua,LIU Jian-kang，CHEN Min-sheng(Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182， China)AbstractAIM: To observe expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), platelet derived growth facto

4、r (PDGF) and c-myc in cultured vascular smooth muscle cells which is effected by neuropeptide Y (NPY) and losartan (the receptor blocking agent of angiotensin ) therefore exploring effects of NPY on the generation of hypertension and its relationship with losartan reverse treatment in molecular biol

5、ogy. METHODS: Applied the method of quantitative immunocytochemistry through ACAS570. RESULTS: 24 hours exposure of vascular smooth muscle cell to NPY caused an increase in expression of PCNA, PDGF and c-myc respectively. But losartan could reverse these expressions by NPY, decreased the expression

6、of PCNA, PDGF and c-myc. CONCLUSION: NPY is closely related to the generation of hypertension. But losartan could reverse these effects of NPY. MeSHNeuropeptide Y; Angiotensin ; Receptors, angiotensin; Muscle, smooth, vascular研究資料表明：losartan對高血壓心肌肥厚、高血壓血管重塑具有良性的治療效應1。有人推測這一作用除了losartan可拮抗血管緊張素受體的作用外

7、，還很可能涉及losartan和神經體液因素中神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)間相互作用及對促進VSMC增殖癌基因的調控。本研究利用體外培養的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)模型，觀察NPY、losartan對體外培養的VSMC中血小板生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)、c-myc癌基因表達的影響，從分子生物學的角度探討NPY在高血壓、動脈粥樣硬化發生中的作用和losartan的保護作用。材料和方法一、血管平滑肌細胞的體外培養組織貼塊法培養血管平滑肌細胞。無菌條件下分離SD大鼠的

8、胸主動脈，剪碎后加入適量含10%胎牛血清的DMEM(GiBco公司產品)培養液，37、5% CO2培養箱中靜置培養。用光鏡和免疫化學方法進行鑒定。選擇生長良好的第67代VSMC用于實驗。二、實驗分組及NPY、losartan條件培養液的配制實驗分為對照組、NPY組、losartan組和NPY+losartan 組。各實驗組分別依次加入NPY、losartan條件培養液各1 mL，對照組為無血清DMEM培養液。NPY(NOVA biochem產品,Switzerland)和losartan (MERCK & CO產品)條件培養液均以無血清的DMEM培養液配制，NPY與losartan終濃

9、度分別為10-6mol/L和10-5g/L。三、NPY對VSMC增殖和PDGF和c-myc原癌基因表達的影響及 losartan的逆轉作用選擇第6代生長良好的平滑肌細胞，消化傳代至96孔培養板上，傳代細胞密度為5.0×107/L。細胞經18h的預培養和6h的預處理后，將NPY、losartan條件培養液和無血清DMEM培養液加入實驗組和對照組，37、5% CO2繼續培養24 h。吸去培養液，pH 7.3的PBS洗3次，3%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次。已固定樣品按常規免疫組織化學方法處理。首先，5%正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min；傾去血清，滴加稀釋度為150鼠抗大鼠

10、細胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、PDGF和c-myc的單克隆抗體(美國Santa Cruz公司產品)，4冰箱過夜。樣品傾去抗體孵育液，PBS洗3次，換加110 FITC熒光標記兔抗鼠抗體(天象人公司產品)，室溫孵育40 min后，PBS充分洗板，每待測樣品加入20L PBS后，分別置帶電腦激光掃描共焦顯微細胞儀(ACAS575UVC型，美國MERIDIAN公司)下,選用40×物鏡,7%濾光片,確定激發光波長為488 nm,進入Kinetics-Image Scan程序,預掃描后選定最佳參數,對選定視野掃描并存儲所獲信息

11、。掃描細胞總數在200個以上。四、結果分析進入Kinetics-Image Analysis程序，調出各次實驗存儲信息，分析并作綜合處理，均數間差異顯著性用t檢驗。結果均以<"01.jpg (732 字節)" src="/med/cano/201003/20100309195632762.jpg" 15 17>±s表示。結果一、血管平滑肌細胞鑒定倒置顯微鏡下，細胞生長呈典型的“谷與峰”結構特征，-actin單克隆抗體免疫細胞化學顯示95%為陽性VSMC。二、NPY對VSMC增殖能力和PDGF、c-myc原癌基因表達的影響以及losa

12、rtan的逆轉作用將免疫熒光顯示技術和帶電腦激光掃描共焦顯微細胞儀的檢測技術結合起來可較為準確地定量細胞中核酸和蛋白質的變化，樣品中被檢測物質的多少是以其檢測物質被熒光標記的平均熒光值來表示。NPY組、losartan組、NPY+losartan組和對照組中PCNA、PDGF和c-myc原癌基因表達的平均熒光值變化見表1。與對照組相比，NPY組中PCNA、PDGF和c-myc的平均熒光值均高于對照組、其中以PDGF表達差異最為明顯(P0.01)；Losartan組除PDGF外，PCNA、c-myc癌基因表達的平均熒光值與對照組相比明顯降低(P0.05)。Losartan組與NPY組進行比較，

13、兩者之間顯示明顯的差異(P0.05)，而NPY+losartan組與對照組相比，除PDGF外無明顯差異（P0.05），見表1。表1 NPY刺激平滑肌細胞增殖及對PDGF、c-myc基因表達的影響和losartan的逆轉作用 Tab 1The effects of NPY and losartan on vascular smooth muscle cell proliferation and PDGF, c-myc expressions (<"01.jpg (732 字節)" src="/med/cano/201003/20100309195632762.

14、jpg" 15 17>±s，n=200)GroupPCNAPDGFc-mycControl1542.71±200.04815.28±116.481620.26±174.58NPY1648.56 ±232.71*1225.46±101.84*1740.35±205.91*Losartan1338.56±232.71*828.69 ±127.541528.03±152.14*NPY+losartan1544.86±256.061143.00± 172.19*160

15、0.37±146.77     *P0.05,*P0.01,vs control；P0.05，vs NPY 討論血管壁平滑肌細胞的異常增殖或肥大是高血壓、動脈粥樣硬化發病早期血管構型改變的重要的形態學特征，其發生與神經肽Y和血管局部腎素-血管緊張素系統的功能改變密切相關3，4。血管緊張素(angiotensin ，Ang)對心血管系統功能活動的調節，除對血管的直接作用外，還可刺激交感神經末梢釋放腎上腺素，促進醛固酮和抗利尿激素的分泌和釋放。而losartan是臨床上第一個針對血管緊張素受體、阻斷其上述作用的高血壓治療劑5。但是，losartan

16、的降壓作用是否與拮抗血管局部的神經內分泌因素NPY的作用有關，并直接抑制VSMC的增殖而引起血管壁結構的重塑？目前尚無法確定。實驗結果顯示：NPY作用下，VSMC中PCNA、PDGF和c-myc癌基因的表達都比對照組有明顯增加，其中，以PDGF表達增加的最為明顯(P0.01)。這不僅說明NPY可影響VSMC的增殖，而且NPY對血管功能的調節作用，尤其是對VSMC增殖的影響涉及到癌基因環節的調控。PCNA是細胞核中DNA聚合酶的附屬蛋白，其主要生物學作用是促進細胞核中DNA鏈的合成與延伸6；PDGF和原癌基因c-myc則都是重要的核蛋白調控基因，參與細胞的增殖和VSMC由中膜向內膜的遷移7，8。

17、實驗結果表明NPY通過PCNA、PDGF和原癌基因c-myc基因的介導引起VSMC的增殖。因此，在高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發生中，NPY分泌或釋放異常，作用于VSMC引起其癌基因過度表達，成為導致VSMC增殖和遷移的重要因素之一。而在losartan的作用下，與對照組相比，僅PCNA和c-myc癌基因表達降低，說明losartan對正常的平滑肌細胞增殖有一定的影響。PDGF不受影響；但同NPY的作用相比，PCNA、PDGF和c-myc癌基因表達均降低表現出一定的差異。在NPY+losartan組，PCNA與c-myc的表達和對照組相比無明顯差異，這說明losartan對NPY所誘導的

18、增殖作用是有一定的逆轉作用。至于losartan對PDGF的表達未產生影響，這是否與losartan作用濃度(10-5g/L)低于正常人用藥的血藥濃度有關，還是由于不同濃度的losartan對各種癌基因表達的誘導作用存在著一定的差異，尚有待于進一步研究。綜上所述，本實驗結果證明：losartan對高血壓的治療作用可能與拮抗NPY對VSMC增殖的刺激作用有關，并涉及癌基因環節的調控。?基金項目 廣東省自然科學基金資助(980466)黃少華（廣州醫學院第一附屬醫院心臟病研究室，廣東 廣州 510182）劉建康（組胚教研室）陳敏生（第三附屬醫院內科）參考文獻1Bunkenburg B， van Am

19、elsvoort T， Rogg H, et al. Receptor-mediated effects of angiotensin on growth of vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive ratsJ. Hypertension, 1992 , 20(6): 746754 .2吳翠環，任大宏，陳多恩. 神經肽Y對培養的自發性高血壓大鼠動脈平滑肌細胞的影響J. 同濟醫科大學學報，1998，27(1):1921.3劉建康，鄧漪平. 內皮細胞和神經系統間相互作用與動脈粥樣硬化J. 中國動脈硬化雜志，1997，5(3)：272276.4Beck BC, Corson MA. Angiotensin signal transduction in vascular smooth muscle: role of tyrosine kinasesJ. Circ Res, 1997,80(5):607616.5McCoy R. A new class of antihyperten