1、Rapamycin和cyclosporin A對同種排斥過程中TLR5及Foxp3表達的影響 作者：陳富強, 曲莉莉, 張超, 梁婷, 宋靜, 徐佳, 侯桂華【摘要】 目的: 研究雷帕霉素（Rapamycin, RAPA）和環孢素A（cyclosporin A, CsA）體內處理對同種移植小鼠急性排斥過程中TLR5及Foxp3表達的影響。方法: 建立同種皮膚移植模型, 術后給予RAPA或CsA, 1次/d, 連續14 d, 同時設生理鹽水對照組。每日觀察移植物存活狀況。術后選取1、 7、 10、 14、 21 d共5個時間點, 提取受體小鼠脾細胞, RTPCR檢測TLR5及Foxp3 mRNA

2、表達, 探討不同處理組基因表達與移植物生存的相關性。體外實驗利用鞭毛蛋白（flagellin）聯合RAPA和CsA處理正常小鼠T細胞6 h, RTPCR檢測TLR5表達。結果: RAPA和CsA可明顯延長小鼠同種移植皮片存活期。RAPA可促進脾細胞TLR5 mRNA表達升高, 停藥后的第21天仍明顯高于CsA組和對照組（P0.05）; CsA組在第7、 10天有顯著升高, 第21天降低（P0.05）; 3組中最高表達的時間點為移植后第10天, 此時正值排斥高峰期。RAPA可引起Foxp3 mRNA的表達升高（P0.05）, 停藥后仍維持較高水平; CsA組僅在移植后第7、 10天短暫升高, 第

3、14天低于對照組（P0.05）。移植后1、 7、 10、 21 d 3組的TLR5與Foxp3 mRNA變化趨勢正相關。體外實驗中, RAPA或CsA與flagellin聯合使用, 可促進TLR5的表達, 以前者的作用更為明顯。結論: RAPA和CsA在同種移植急性排斥高峰期可引起TLR5和Foxp3表達的協同升高, 且RAPA的作用更加明顯和持久, 鞭毛蛋白體外可以增強這種作用效果。 【關鍵詞】 雷帕霉素; 環孢素A; 同種移植; TLR5; Foxp3; 鞭毛蛋白CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）在維持外周免疫耐受, 調控T細胞免疫應答, 預防移植排斥中起重要作用。轉錄因子Foxp

4、3是Treg的特征性標志, 對其功能的誘導起關鍵作用。研究證實Treg高表達TLR4、 TLR5、 TLR7和TLR8, 其中TLR5活化能夠增強Treg細胞抑制功能, 同時可使Foxp3表達增加, TLR5的特異配體鞭毛蛋白可增強Treg對效應性T細胞的抑制作用。但是同種移植狀態下, TLR5的表達狀況及移植物生存關系的研究鮮見報道。研究移植排斥過程中TLRs對Treg細胞的調節機制, 對探討Treg的免疫抑制機制以及信號轉導通路具有重要的意義。 免疫抑制藥物雷帕霉素 (Rapamycin, RAPA)和環胞素A(cyclosporin A, CsA)廣泛用于器官移植后抗移植物排斥反應, 并

5、且在實驗模型中作為誘導免疫耐受的工具。目前使用的免疫抑制藥物可以通過抑制效應性T細胞的擴增防止移植物的排斥, 但是是否可以誘導激活Treg細胞以及其分子機制仍需要進一步闡明。CsA抑制TCR介導的T細胞激活和IL2的產生, 而RAPA阻斷T細胞生長因子細胞內信號轉導, 因此 CsA和RAPA對CD4+CD25+Treg可能有不同的作用1。研究表明RAPA在體外可以選擇性地擴增CD4+CD25+調節性T細胞, 而不阻斷其他類型T細胞的擴增和活化, 誘導細胞凋亡2。 我們前期的研究證實RAPA和CsA體內處理可以明顯增加同種移植受體的Treg比例, 增強Foxp3的表達。但是即使體內使用RAPA,

6、 同種移植個體中的Treg比例仍然處于較低水平3。如何通過調節Treg細胞活性, 在體內擴增Treg細胞, 更好地誘導同種移植耐受仍是亟待解決的問題。2008年有研究報告4, 體內給予TLR5特異配體flagellin, 可以保護機體免受化學、 病毒和輻射等損害。鑒于TLR5的表達有助于免疫保護的形成, 我們推測同種移植個體的TLR5的活化可能有助于Treg的激活和移植耐受的形成。因此利用RAPA和CsA處理小鼠同種移植模型, 研究急性排斥過程中體內TLR5及Foxp3表達量的動態變化趨勢, 探討在急性同種移植排斥過程中TLR5和Foxp3表達與移植物生存的關系及兩種抗排斥藥物的作用, 旨在為

7、利用TLR5特異配體和RAPA進行同種移植耐受誘導奠定基礎。1 材料和方法1.1 材料 BALB/c小鼠(H2d), 由山東大學實驗動物中心提供; C57BL/6 (H2b, B6)小鼠, 由上海實驗動物中心提供。以上小鼠均為雌性, 812周齡, 均飼養在恒溫(2527)、 恒定濕度(45%55%)無特殊病原菌(SPF級)環境中。RAPA購自美國Sigma公司, CsA 購自Novartis Pharama公司, RTPCR及PCR試劑盒購自TaKaRa公司, Foxp3、 TLR5引物及GAPDH引物由博尚生物技術服務有限公司合成。副傷寒桿菌鞭毛蛋白flagellin (本室參照文獻5制備）

8、。12 方法121 小鼠同種移植模型制備 參照文獻6進行。制備全厚度小鼠軀干皮膚移植物并行移植術。脫椎法處死供體小鼠（B6）, 取全厚度軀干部皮膚, 去除皮下脂肪及血管, 剪成1 cm2大小的皮片備用。然后給受體BALB/c小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 g/g體質量）行麻醉術, 在小鼠右背部制備移植床, 將供體皮片置于移植床, 包扎固定后逐日觀察移植物排斥狀況。當移植皮片壞死達50%時, 即為完全排斥。122 實驗分組及模型的耐受誘導 將移植過皮片的BALB/c小鼠隨機分為3組, 每組15只。對照組: 術后腹腔注射生理鹽水, 0.2 mL/只, 連續14 d; CsA處理組: 術后注射CsA,

9、 10 mg/(kg·d), 連續14 d; RAPA處理組: 術后腹腔注射RAPA, 1.5 mg/(kg·d), 連續14 d（此時對照組移植皮片全部排斥掉, 故停藥）。123 TLR5及Foxp3 mRNA的表達 分別于移植后第1、 7、 10、 14、 21天, 取實驗組對照組小鼠脾臟, 提取脾細胞, 采用異硫基氫酸胍（TRIzol）一步法提取細胞總RNA, 半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）對轉錄產物進行擴增, 以三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參對照。1 TAE制備15 g/L的瓊脂糖凝膠, 加入濃度為0.5 mg/L的溴化乙啶（EB）染色。取PCR反

10、應產物10 L與2 L上樣緩沖液混合后點樣于凝膠孔電泳, 以相對分子質量（Mr）2 000的Marker做標準判斷PCR產物片段大小, 恒壓5 V/cm電泳50 min, 然后用凝膠掃描儀在A260波長紫外光下觀察并掃描。用FR200UV/WHITE ANALYSIS及Photo Impact SE系統對電泳結果作圖像分析。實驗結果以檢測條帶與GAPDH條帶的總灰度值的比值作為待測目的片段的相對值。124 flagellin聯合RAPA、 CsA體外處理對TLR5的影響 通過小鼠T淋巴細胞純化柱（Mouse T Cell Enrichment Columns）純化BALB/c小鼠脾臟T細胞,

11、106/孔接種于24孔培養板上; 加入B6小鼠可溶性同種抗原6, 實驗分6組: 對照組（不加任何藥物處理）、 flagellin組（100 g/L）、 RAPA（15 mg/L）組, CsA組（15 mg/L）, flagellin（100 g/L）+RAPA（15 mg/L）組、 flagellin（100 g/L）+ CsA組（15 mg/L）; 每組3個復孔, 37、 50 mL/L CO2培養箱中培養6 h后收集細胞, RTPCR檢測TLR5表達量, 用FR200UV/WHITE ANALYSIS及Photo Impact SE系統對電泳結果作圖像分析, 以檢測條帶與GAPDH條帶的總

12、灰度值的比值作為待測目的片段的相對值。125 統計學分析 計量資料以x±s表示, 采用SPSS12.0統計軟件進行數據分析, 進行t檢驗和方差分析, P0.05為差異有統計學意義。2 結果21 RAPA及CsA對同種移植皮片存活時間的影響 與對照組（13.2±1.5 d）相比, 雷帕霉素組（22.8±2.1 d）和CsA組(22.0±1.9 d)移植皮片的存活時間均明顯延長, 有統計學意義(P0.05, 圖1)。雷帕霉素組和CsA組間雖然無統計學意義, 但CsA組小鼠一般生存狀態較差。22 RAPA及CsA誘導對TLR5及Foxp3 mRNA表達的影響

13、（1）TLR5 mRNA表達狀況: 如圖2所示, 與對照組相比, 同種移植后, 特別是第1、 7、 10、 21天, RAPA體內處理組脾細胞TLR5 mRNA表達明顯上調（P0.05）。而CsA處理組的TLR5表達在第7、 10天有明顯升高, 第21天明顯下降。此時低于對照組（P0.05）。3組中的TLR5 mRNA表達最高的時間點是同種移植后第10天, 此時正值排斥高峰期。（2）Foxp3 mRNA的表達變化: 未處理組同種移植后第10天Foxp3表達顯著升高, 此后迅速下降, 第14天恢復至正常水平（圖3）。CsA組移植后第7天開始升高, 第10天達到高峰（P0.05）, 第14天明顯下

14、降; RAPA組移植后第1天的Foxp3表達明顯升高, 第10、 14天達到高峰（P0.05）, 第21天仍明顯高于未處理組和CsA組; 移植后第7天, 第10天的RAPA組和CsA組的Foxp3表達無顯著差異（P0.05）。但是CsA組移植后第14天Foxp3表達較RAPA組顯著下降（P0.05）。結果提示RAPA處理組的Foxp3表達持續升高可能是其延長移植物存活時間的機制之一。圖1 RAPA和CsA對同種移植皮片存活時間的影響（略）Fig 1 Effect of RAPA and CsA on the survival time of allograft圖2 RAPA和CsA對同種移植受

15、體TLR5 mRNA表達的影響（略）Fig 2 Effect of RAPA/CsA on the expression of TLR5 mRNAaP0.05 vs control.23 TLR5與Foxp3基因表達的相關性 如圖4所示, 同種移植后TLR5和Foxp3的表達均在排斥高峰期（移植后第10天）升高最明顯, 之后Foxp3的表達迅速下降, 而TLR5的表達持續移植后14 d才開始下降。而體內給予CsA后, TLR5和Foxp3的表達第7天就明顯升高, 第10天達到高峰, Foxp3在第14天恢復至起始水平, 而TLR5在第21天恢復至起始水平（圖5）; RAPA體內處理組的TLR5

16、和Foxp3的表達從移植后就開始同步升高, 第10天達到高峰, 第21天恢復至初始水平（圖6）。統計學分析顯示, 小鼠皮片急性移植排斥期1、 7、 10、 21 d, 移植受體脾細胞的TLR5與Foxp3變化趨勢明顯正相關, 且免疫抑制藥物CsA與RAPA均顯著上調它們的表達, RAPA上調效果最為明顯。圖3 RAPA和CsA對同種移植個體Foxp3 mRNA表達的影響（略）Fig 3 Effect of RAPA/CsA on the expression of Foxp3 mRNAaP0.05 vs control.圖4 同種移植排斥過程中TLR5與Foxp3基因表達的相關性（略）Fig

17、4 Relationship of TLR5 and Foxp3 mRNA expression during allorejection圖5 CsA 對同種移植排斥過程中TLR5與Foxp3基因表達的影響（略）Fig 5 Effect of CsA on expression of TLR5 and Foxp3 mRNA during allorejection24 T細胞體外培養后TLR5的表達 與對照粗相比, 小鼠脾T細胞體外培養6 h后, flagellin處理組、 flagellin+RAPA聯合處理組、 flagellin+CsA聯合處理組的TLR5 mRNA均明顯高表達（P0.0

18、5）, 其中flagellin+RAPA聯合處理組增高更明顯, 而單獨用CsA處理、 RAPA處理組的TLR5 mRNA無統計學意義。圖6 RAPA對同種移植排斥過程中TLR5與Foxp3基因表達的影響（略）Fig 6 Effect of RAPA on expression of TLR5 and Foxp3 mRNA during allorejection圖7 flagellin, RAPA和CsA對小鼠T細胞TLR5表達的影響（略）Fig 7 Effect of flagellin, RAPA and CsA on expression of TLR5 of T cellsaP0.05

19、 vs control.3 討論 迄今為止發現的TLRs家族多數對免疫應答起激活增強作用, 如TLR2、 TLR4等, 而TLR5作為一種特殊的TLRs, 對免疫應答具有負調節作用。目前發現TLR5的唯一配體是細菌鞭毛蛋白（flagellin）。因此選擇TLR5, 研究其在同種移植排斥中的表達及意義, 可以為利用flagellin誘導移植耐受奠定實驗基礎。隨著近年來對Treg作用機制研究的日益深入, 越來越多的證據證實在機體正常及疾病狀態下, 病原相關分子模式（PAMPs）可通過Toll樣受體調節CD4+CD25+調節性T細胞的增殖及功能。如, TLR2缺陷小鼠CD4+CD25+調節性T細胞數

20、量明顯減少, 且TLR2的配體能夠在體外培養中促進其增殖, 表明TLR2對于調節性T細胞的擴增和和抑制活性的維持非常重要; 小鼠CD4+CD25+調節性T細胞選擇性的高水平表達TLR1、 2、 4、 5、 7和8, 且LPS可與CD4+CD25+Treg上TLR4結合增強Treg細胞抑制能力, 小鼠CD4+CD25+調節性T細胞表面TLR4的配體能夠增強細胞的抑制能力; 與此不同的是TLR8的配體能夠直接作用于CD4+CD25+調節性T細胞, 并降低其抑制能力7。因此, 不同TLRs對CD4+CD25+調節性T細胞具有不同作用。CD4+CD25+T細胞高表達TLR4及TLR5 mRNA, 作為

21、一種協同刺激分子, TLR5可能通過影響Foxp3的表達而增強CD4+CD25+調節性T細胞的抑制能力。 CsA和RAPA都是臨床器官移植患者的常用藥, 可以減少免疫細胞的增殖和活化, 進而抑制移植排斥反應。二者聯合使用能減少腎移植術后急性排斥反應的發生率, 然而這兩種藥物對Treg的影響卻不同。腎移植病人, 術后使用RAPA, 體內Treg的比例與健康人無顯著差異, 明顯高于術后使用CsA組8。 本研究證實, 同種移植急性排斥高峰期, TLR5和Foxp3表達升高, 給予CsA與RAPA, 對移植受體TLR5和Foxp3表達的影響不同, 二者雖然都可引起移植排斥高峰期的TLR5和Foxp3表

22、達升高, 但RAPA作用更強, 尤其是引起Foxp3表達持續升高, CsA也可促進這兩種基因的表達, 但持續時間較短。提示RAPA抗移植排斥的機理之一可能是通過激活Treg發揮作用。體外研究結果提示, flagellin可以激活T細胞的TLR5表達, RAPA可以加強這一作用, 因此有望利用flagellin聯合RAPA進行移植耐受的誘導。至于flagellin通過什么樣的信號途徑, 其與RAPA作用途徑是否有交叉, 及相互影響的進一步意義等, 這些誘人的問題尚待研究。【參考文獻】 1 Coenen JJ, Koenen HJ, van Rijssen E, et al. Rapamycin,

23、 and not cyclosporin A, preserves the highly suppressive CD27+ subset of human CD4+CD25+ regulatory T cellsJ. Blood, 2006, 107(3): 1018-1023.2 Battagia M, Stabilini A, Roncarolo MG, et al. Rapamycin selectively expands CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cellsJ. Blood, 2005, 105(15): 4743-4748.3 鄭永先, 侯桂華, 宋 靜, 等 雷帕霉素對同種移植耐受模型CD4+CD25+T細胞活性的影響J 細胞與分子免疫學雜志, 2007, 23（4）: 327-3304 VijayKumar M, Aitken JD