1、衛生微生物學實驗指導（僅供預防醫學本科教學使用）姓 名 年 級 班 級 指導老師 衛生微生物學實習指導實驗一 自來水中指示微生物的檢測 菌落總數的測定目的及意義掌握菌落總數實驗的基本原理和意義；熟悉水樣采集要求，熟悉菌落總數實驗的全部過程和具體操作方法；了解無菌操作和避免污染的概念。根據不同目的，選擇有代表性的一種或一類微生物，對檢測、研究對象中的該微生物狀態進行定性或定量的描述，并賦予其特定的標志意義，這類微生物即所謂的指示微生物。指示微生物在污水與飲用水處理、環境監測、產品質量控制、消毒滅菌、衛生監督等領域廣泛應用。最常用的為菌落總數和大腸菌群，菌落總數用于評價被檢測樣品的一般衛生微生物學

2、質量，即微生物污染程度和安全性。菌落總數是指被檢測樣品在單位重量（g）、溶劑（ml）、表面積（cm2）或體積（m3）內，所含有的能在某種培養基上經過一定條件培養后生長的微生物菌落總數。儀器設備和試劑1. 儀器設備 電子天平、pH計、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺。2. 器材和試劑 100-1000l移液器、1000l吸頭、廣口旋塞試劑瓶、培養平皿；1.5%硫代硫酸鈉溶液、營養瓊脂。實驗方法1、 樣品來源 內蒙古醫科大學金山校區C座自來水2、 實驗準備1. 配置1.5%硫代硫酸鈉溶液2. 取400l 1.5%硫代硫酸鈉溶液加入容積為250 ml的藍蓋試劑瓶中，該瓶作為為取樣瓶（硫代硫酸鈉的作用是中和

3、自來水中的消毒劑）。3. 準備3個洗干凈的培養平皿，用報紙包嚴。4. 配置80ml固體營養瓊脂。5. 將上述取樣瓶、營養瓊脂和培養平皿101.3kPa高壓蒸汽滅菌20分鐘。6. 滅菌過程中將超凈工作臺或無菌室打開紫外燈照射30min。3、 樣品采集 1.先對欲采集樣品的水龍頭進行消毒，然后將水龍頭完全打開，放水5分鐘后收集樣品，采水量為瓶容量的80%左右。 2.采樣后及時做好標記，開始檢測。1四、檢測步驟1.將水樣用力搖2025次，使微生物充分的分散開來。2.分別稀釋水樣10倍、100倍、1000倍與水樣原液一起待檢。 3.取兩個干凈無菌的空平皿，分別標注“1”和“2”。在1號平皿中加入1ml

4、水樣后傾注1520ml已熔化并冷卻45左右的營養瓊脂，并立即旋轉平皿使水樣與瓊脂充分混勻（順時針旋轉3次、逆時針旋轉3次、左右前后各晃3次，注意動作不可太大，避免損失），然后將平皿放在水平面上待凝，同樣的方法制備2號平皿。再取一個干凈無菌的空平皿，只傾注營養瓊脂做空白對照。 3.待平皿內培養基冷卻凝固后翻轉平皿，使底面向上，37培養48小時后取出，計數平皿內的菌落數目。結果分析分別計數1號平皿和2號平皿里的菌落總數，取平均菌落數即為1ml水樣中的菌落總數，并參考表1-1、1-2判斷該水樣是否符合微生物限量標準。組 別： 檢測水樣的稀釋度：1號平皿菌落總數： 2號平皿菌落總數：該自來水中每毫升可

5、檢出的菌落總數是多少？請給出計算步驟。討論1. 利用本實驗方法是否可測得水中的全部細菌？為什么？2. 本方法為什么主要是檢測細菌菌落數，而不是霉菌或酵母菌？23. 菌落總數主要是作為判定受檢水樣污染程度的標志，以便對水質進行衛生學評價時提供依據。能否根據菌落數多少判斷被檢樣品致病性強弱？為什么？4.如果改變培養基成分、培養時間或培養溫度，菌落數或菌落種類是否也隨之改變？5.請寫出硫代硫酸鈉中和自來水中消毒劑的反應方程式表1-1 一般水源水中菌落總數與水清潔程度的關系水的類別 菌落總數（CFU/ml）最清潔水 10100清潔水 1001000不太清潔水 100010 000不清潔水 10 000

6、100 000 極不清潔水 100 000表1-2 我國頒布的有關飲用水的微生物限量標準項目GB5749-1985GB8537-1995GB17324-2003GB5749-2006菌落總數（CFU/ml）1005020100大腸菌群（CFU/100ml）3003不得檢出霉菌、酵母菌及致病菌不得檢出不得檢出不得檢出不得檢出3實驗二 細菌質粒提取及其圖譜分析目的及意義掌握堿裂解法提取質粒DNA的方法。由于細菌質粒特征相對穩定，不同菌株的質粒數量、大小及酶切后DNA片段電泳圖譜具有相對特異性，因此質粒圖譜分析可用于細菌的鑒定和分型。質粒圖譜分析 (plasmid profile analysis,

7、 PP分析)是根據質粒DNA電泳條帶所構成的特征性圖譜來分析質粒和菌株特性的技術，包括質粒指紋圖譜和質粒酶切圖譜。質粒指紋圖譜分析是對提取的質粒DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，不同菌株質粒數目和分子量大小不同而呈現不同電泳條帶所組成的圖譜，比較電泳條帶數目和大小異同，分析不同菌株質粒的數目和分子量大小特征。現從某水源水樣品中分離出兩株大腸桿菌，已知這兩株細菌的形態、大小及生化特征都比較相似，請用質粒圖譜法進行鑒定這兩株細菌是否是同一菌種。基本原理堿裂解法是一種相對劇烈的裂解細菌的方法，適用于小質粒 (15kb) 的分離提取。菌體在NaOH和SDS的作用下被裂解，細菌的蛋白質變性，同時釋放出質粒DNA

8、和基因組DNA，兩種DNA在強堿環境中都發生變性。由于質粒和基因組的拓撲結構不同，變性時前者雖然兩條鏈分離，卻仍然纏繞在一起不分開，但后者完全變性分開甚至出現斷裂。因此，當使溶液pH值恢復近中性水平時，質粒的兩條小分子單鏈可迅速復性恢復雙鏈結構，但是基因組染色體DNA則難以復性。在離心時，大部分基因組染色體與細胞碎片，雜質等纏繞一起被沉淀，而可溶性的質粒DNA留在上清夜中。儀器設備和試劑儀器 超凈工作臺，恒溫培養箱，震蕩培養箱，臺式高速離心機，漩渦振蕩器，電泳儀及水平瓊脂糖電泳設備，凝膠觀察成像系統，-20冰箱等；器材 培養平皿，10ml試管，1.5mlEP管，100-1000l微量移液器，1

9、0-200l微量移液器，計時器，吸水紙等；試劑 LB固液培養基，質粒提取用溶液、，無水乙醇，超純水，電泳緩沖液，上樣緩沖液，溴化乙錠 (EB) 核酸染料，DNA Marker，溴酚藍；菌株 大腸埃希菌DH5 (含有pBR322-LEU) 和大腸埃希菌V517。5實驗方法對A，B兩株細菌進行質粒分型1. 挑取LB固體培養基上生長的單菌落（A，B），并分別接種于5ml LB（含Amp100g/ml）液體培養基中，37、180rmp振蕩培養過夜（約12-14hr）。2. 取1.5ml培養液于1.5ml EP管中，12000rmp離心1min。棄上清，盡量除盡培養液。3、加入100l溶液 (配方見附表

10、) 重懸菌體 (劇烈振蕩，使菌體分散混勻),室溫放置5min。4、加入新配制的溶液 (配方見附表) 200l，蓋緊管口，快速溫和顛倒6次(千萬不要振蕩)，冰浴5 min。5、加入200l預冷的溶液 (配方見附表) ，蓋緊管口，將管溫和顛倒數6次混勻，見白色絮狀沉淀，在冰上放置5min。 6、4，12000rmp離心10min。上清液移入干凈EP管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻, 12000rmp離心10min。（500l的苯酚/氯仿/異戊醇。）7、小心移出上清于一干凈EP管中，加入1ml預冷的無水乙醇，混勻，-20放置15min，4，12000rmp離心10min。8、棄上清，將管

11、口敞開倒置于衛生紙上使所有液體流出，1ml 70乙醇洗沉淀兩次。9、 吸除上清液，將管倒置于衛生紙上使液體流盡，室溫干燥。10、將沉淀溶于20l 無菌超純水中，標記好，4冰箱保存待電泳觀察結果。11、配制1瓊脂糖凝膠，將稱好的瓊脂糖粉放入三角燒瓶中，加入1TBE緩沖液，搖勻后放入微波爐中煮沸三次，涼至不燙手時加入EB（終濃度0.5g/ml）搖勻，倒入提前插好梳子的膠板槽中，置于平面上待凝。12、將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，加入適量的1TBE緩沖液，取5l質粒溶液混入1l溴酚藍上樣，調整電壓(80V，200A)，開始電泳。13、待樣跑至距離凝膠邊緣約1厘米時停止電泳，將膠置于紫外成像儀下觀察結果。

12、結果分析組別:根據實驗質粒電泳條帶的位置并對照DNA Marker，繪制質粒圖譜并估測質粒分子量大小。（E.coliV517含8個質粒，分別為54.4、7.3、5.6、5.2、4.0、3.0、2.7、2.1kbp）結果討論:討論不同菌株帶有分子量相同的質粒，可以認為這些質粒一定是相同的嗎？如何進一步驗證？注意事項EB為致癌劑，本實驗中凡是接觸到該試劑的操作步驟都應戴PE手套。附表（1）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) , 10 mmol/L EDTA (pH8.0) , 配制200ml。 取葡萄糖（C6H12O6.H2O）1.982 g，雙

13、蒸去離子水160 ml，0.5 mol/L EDTA 4ml，1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5 ml，定容至200 ml，高壓滅菌后4保存。（2）溶液II：0.2 mol/L NaOH, 1%SDS。 配制100 ml，現用現配。 10 mol/L NaOH 2 ml，雙蒸去離子水80 ml，10%SDS 10 ml，最后用雙蒸去離子水定容至100 ml，室溫保存。（3）溶液III：配制100 ml。 5 mol/L 乙酸鉀 60 ml，冰乙酸11.5 ml，雙蒸去離子水28.5 ml。6實驗三 綜合設計實驗本次實驗給出兩個題目，學生自選題目并提前預寫實驗報告，學生可利用網絡、圖書館等平臺進行資料查找。