1、土壤蛋白酶活性測定(茚三酮比色法)實驗試劑：1、pH7.6的0.05mol/L的trisHCL緩沖液(三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液):50ml0.2mol/L的三羥甲基氨基甲烷與27.5ml0.2mol/L的鹽酸混合,稀釋成200ml。2、2%酪酸鈉溶液:稱取2g 酪酸鈉,加入10ml0.1mol/L的NaOH溶液,沸水浴處理5min,待膨化后加入pH7.6的trisHCl緩沖液約80ml,繼續沸水浴處理,直至完全溶解,用同樣的緩沖液定容至100ml。3、TrisHClCaCl2混合溶液:用pH7.6的0.05mol/LtrisHCl緩沖液配制的0.01mol/L的CaCl2溶液。4、0.6mo

2、l/L乙酸鉛溶液。5、草酸鈉乙酸混合溶液:每1000ml0.26mol/L的草酸鈉溶液含有240.7ml0.2mol/L的乙酸。6、茚三酮乙醇抗壞血酸混合試劑:稱取2g茚三酮,0.02g 抗壞血酸,溶于100ml無水乙醇。7、0.2%KIO3溶液。8、pH5.8乙酸乙酸鈉緩沖液:94 ml0.2mol/L乙酸鈉與6ml0.2mol/L乙酸混合。9、0.01%甘氨酸標準溶液:1g甘氨酸溶于1000ml水,再稀釋10倍。10、甲苯。以上試劑均為分析純。實驗儀器:基本儀器如試管、燒杯等、離心機、分光光度計、刻度試管、水浴鍋、電子天平、移液管實驗步驟1、 標準曲線的繪制 分別吸取50 、100、150

3、、200、250、300l0.01%甘氨酸標準溶液,置于10 ml刻度試管中(濃度分別相當于NH2 0.107、0.213、0.320、0.426、0.533、0.639g/ml),加入2mlpH5.8的乙酸乙酸鈉緩沖溶液 加入1.5ml 茚三酮乙醇抗壞血酸混合試劑,混合均勻,沸水浴加熱16min 取出立即用自來水冷卻15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均勻,用蒸餾水定容至10ml,1h內在570nm處比色測定吸光值;以氨基氮(NH2)的濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。2、培養與測定 稱取0.200g土壤,加入2mlTrisHClCaCl2混合溶液和1ml甲苯,混合均勻后靜

4、置15min以抑制微生物活性； 然后再加入5ml2%的酪酸鈉溶液,50振蕩培養2h。對照土壤在培養過程中不加酪酸鈉溶液,但在培養結束后加入,且加入的酪酸鈉也經歷50、2h的振蕩培養過程。 培養結束并在對照中加入酪酸鈉后,充分混合,置于04冷藏柜中靜置30min。取出加入1.5ml0.6mol/L乙酸鉛溶液,6000r/min離心10min,取上清液1.5ml,加入457l草酸鈉乙酸混合溶液,17000r/min再離心10min； 小心吸取1ml上清液，置于10ml刻度試管中,加入2mlpH5.8的乙酸乙酸鈉緩沖溶液,再加入1.5ml茚三酮乙醇抗壞血酸混合試劑,混合均勻,沸水浴加熱16min,取

5、出立即用自來水冷卻15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均勻,用蒸餾水定容至10ml,1h內在570nm處比色測定吸光值。注:每個土樣設置5個重復。結果計算NH2(g)=a×150式中,a為比色液吸光值在標準曲線上對應的濃度,單位為(NH2g/ml),150為換算為每個樣品NH2總含量的系數。蛋白酶的活性以50培養2h,5g土壤中NH2的g 數表示(為便于比較,也可以換算為1g烘干土,表示為NH2g/g烘干土)。 芳基硫酸酯酶的活性測定（比色法）1. 方法原理：芳基硫酸酯酶酶促有機硫化物脫硫成為無機形態。基于堿性條件下，芳基硫酸酯酶作用n-硝基酚硫酸酯，比色測定水解生成的酚量表

6、示酶的活性。2. 藥品及試劑配置：對硝基酚硫酸鉀，醋酸，CaCl2·2H2O,NaOH，對硝基酚，甲苯 0.005 mol/L 對硝基酚硫酸酯溶液：0.1287g 4-硝基苯硫酸鉀（對硝基苯基硫酸鉀）溶于醋酸緩沖液（Ph=5.8），并用同一緩沖液將溶液定容至100 mL 溶液保存在冰箱中。 0.5 mol/L醋酸緩沖液（Ph=5.8） 0.5 mol/L CaCl2·2H2O 0.5 mol/L NaOH n-硝基酚標準溶液：取1 g 對硝基酚溶于水并定容至1 L (1 mL含1 mg)標準曲線的繪制：取1 mL 對硝基酚標準溶液稀釋至100 mL（1 mL含10 g），然

7、后取不同量的稀釋液配成系列，用以測定芳基硫酸酯酶活性相同的方法，使對硝基酚顯色，比色后制成標準曲線。3. 操作步驟： 加幾滴甲苯1 g 土壤置于50 mL三角瓶-再加4 mL醋酸緩沖液（Ph=5.8）-加1 mL 0.005 mol/L 對硝基酚硫酸酯-搖蕩，蓋緊，于37 恒溫箱培養1 h。 培養結束，加1 mL 0.5 mol/L CaCl2 和4 mL0.5 mol/L NaOH，用慢速濾紙過濾，培養混合物，取濾液在分光光度計上于400 nm 處比色，測定濾液的黃色深度。 試驗需設無基質對照。 其它測定方法 土壤芳基硫酸酯酶活性，以1 g 土壤在1 h內釋出的對硝基酚的微克數表示。一種檢測

8、土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法，其特征在于：）分別稱取鮮土樣品份分別置于個三角瓶中，分成二組，每組個，向個三角瓶中加入乙酸緩沖溶液，向第一組個三角瓶中加入 （0.0250.050mol）.-1的底物對硝基苯硫酸鉀工作液，第二組個三角瓶作底物試劑對照，混勻，蓋好瓶塞，放在恒溫培養中恒溫培養；）培養結束后，加入.-1堿性（三羥基氨基甲烷）溶液和.-1氯化鈣溶液，并向第二組三角瓶中加入.-1的底物對硝基苯硫酸鉀工作液，混勻，過濾；）用分光光度法于410處分別測定上述所得三角瓶中溶液的吸光度；以對硝基苯酚溶液標準溶液，以對硝基苯酚溶液的系列濃度和其分別用分光光度法在測定的吸光值制作工作標準曲線，得到

9、斜率；根據吸光值和斜率，計算所測定濾液中對硝基苯酚的濃度，；計算樣品中對硝基苯酚含量；）計算磷酸單酯酶酶活性：計算公式為：（×）.干土.式中：單位 土壤單位時間內對硝基苯酚的產生量；：測試溶液中對硝基苯酚的質量，樣品測定吸光值折換的產物質量值；：鮮土樣品質量；：水分系數，單位重量的烘干土重鮮土重。過氧化物酶活性分原理過氧化物酶能氧化土壤中的有機物質，過氧化物酶酶促鄰苯三酚氧化為醌，用乙醚提取生成紫色沒食子素，比色著色的乙醚相，該乙醚相在430nm處有最大光吸收值，采用的是鄰苯三酚比色法。步驟（1）標曲的制作： 重鉻酸鉀標準溶液的配制：稱取0.75g重鉻酸鉀溶于1L0.5mol/LHc

10、l（相當于50mL乙醚中含5mg紫色沒食子素）。表4 重鉻酸鉀標準曲線配置 編號012345678 標液/mL00.51.52.53.54.55.56.57.5 0.5mol/LHcl/mL109.58.57.56.55.54.53.52.5 光吸收值0.040.1320.2280.3170.4050.50.5830.688混合均勻后在430nm處比色。以吸光值為橫坐標、沒食子素的含量為縱坐標計算直線回歸方程y=a+bx及相關系數R，即沒食子素含量C（mol）=a+b×A430，通過計算得到回歸方程為：C（mmol）=-0.0005+0.1091 A430,R=0.9998,R2=0

11、.9997（2）過氧化物酶活性測定：稱取0.16g砂土于10ml離心管中，加入2mL1%鄰苯三酚溶液和0.4mL0.5%H2O2溶液，充分振蕩混合均勻，30恒溫箱培養2小時；加入0.8mLpH4.5檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，加入7mL乙醚，充分振蕩，萃取30min;吸取乙醚相液體在430nm處比色。計算方法土壤過氧化物酶活性用每克土中沒食子素的毫克數表示，即（mg / h g W）=C×V×稀釋倍數/（W×t）式中： C標準曲線上查得樣品中沒食子素濃度（mg /mL）；V樣品反應的總體積（mL）；t 反應時間（h）； W樣品土壤的重量（g）；脲酶（比色法）1. 試劑的

12、配制：1) PH=6.7檸檬酸鹽緩沖液的配制： 368g檸檬酸，加入600mL蒸餾水及295gKOH溶解 ，混勻并定容至2L，用1mol/LNaOH調PH=3.62）苯酚鈉溶液： 稱取62.5g苯酚，溶于少量乙醇，加入2mL甲醇及18.5mL丙酮， 加乙醇稀釋至100mL（A液），存入冰箱 稱取27gNaOH溶于100mL水中（B液）存入冰箱3）次氯酸鈉溶液 用水稀釋制劑，至活性氯濃度為0.9% 至溶液穩定4）10%尿素液5）甲苯6）N的標準溶液： 精確稱取0.4717g硫酸銨，定容至1L，則得1mL含0.1mg 氮的標準液，繪制標準曲線時，可再將此液稀釋10倍供用。 標準曲線繪制：吸取稀釋的

13、標準液1，3，5，7，9，11，13 mL移于50 mL容量瓶中，然后加蒸餾水至20 mL。再加4 mL苯酚鈉溶液和3 mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容，1h內在分光光度計上于波長578nm處根據光密度值與溶液濃度繪制標準曲線。操作步驟： 5 g 風干土置于50 mL 三角瓶中，加1 mL 甲苯-15 min后-加10 mL 10尿素液和20 mL pH=6.7 檸檬酸鹽緩沖液-搖勻，在37 恒溫箱中培養24 h -過濾后取 3 mL 濾液注入50 mL容量瓶中，然后按繪制標準曲線顯色方法進行比色測定。計算：脲酶活性以24 h后1 g 土壤中 NH3N 的毫克數表示. NH

14、3-N（mg）= a*2 式中，a-從標準曲線查得NH3-N 毫克數 2-換算成1 g 土的系數法二 土壤脲酶測定（改進的）待測土樣風干，過80目篩。精確稱取0.200g土樣于10ml圓底塑料離心管中，加入0.2ml甲苯，振蕩搖勻。15分鐘后，加入2ml 10%尿素溶液和4ml pH=6.7的檸檬酸鹽緩沖液，加蓋搖勻，于37培養24小時。取出后搖勻，于3800r離心5分鐘，吸取上清液0.6ml于10ml試管，加入3.4ml蒸餾水，再加入0.8ml苯酚鈉溶液和0.6ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。待30分鐘后顯色，加入4.6ml蒸餾水，定容至10ml。于1小時內，在578nm下比色，記錄光吸收值。

15、標準曲線的繪制：精確稱取0.0472g硫酸銨，加蒸餾水溶解，定容至1L，則1ml含0.01mg氮的標準溶液。分別吸取氮的標準溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6ml于10ml離心管中，對照組不吸取氮的標準溶液，分別加入蒸餾水至4ml，再加入0.8ml苯酚鈉溶液和0.6ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。待30分鐘后顯色，加入4.6ml蒸餾水，定容至10ml。于1小時內，在578nm下比色，記錄光吸收值。以標準溶液濃度為橫坐標，以光吸收值為縱坐標繪制標準曲線。酸性磷酸酶活性測定（一）原理該方法以對硝基苯磷酸二鈉（即pNPP）為基質，基質在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黃色色的對硝

16、基苯酚（即pNP），該黃色溶液在410nm處有最大吸收光值，根據對硝基苯酚的生成數量與黃色溶液的吸光度呈正比來進行定量分析，以此來反映土壤酸性磷酸酶的活性，采用的是對硝基苯磷酸二鈉比色法。（二）測定方法稱取壤土0.3g、砂土0.5g、粘土0.1g風干土于50 mL離心管中，加入0.2 mL甲苯和4 mL MUB（MUB即通用緩沖液， pH =6.5），再加1 mL 0.05 mol/L對硝基苯磷酸鈉溶液 （用MUB配），搖勻后加蓋，放進3637的培養箱中進行培養1個小時；培養完成后取出加入0.5 mol/L的CaCl2 1 mL 及0.5 mol/L的NaOH 4 mL，搖勻；而后轉入10mL

17、塑料離心管中在2500r/min下離心5min；取上清液在410 nm處比色，并記錄吸收光值。（三）標準曲線的制作 取9支玻璃試管，按順序編號，并按表2加入試劑。表2對硝基苯酚標準曲線配制表離心管號 0 1 2 3 4 5 6 7 80.05?mol/mLpNP（mL） 0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7H2O（mL） 0.8 0.75 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1pNP的含量（?mol） 0 ；0.0025；0.005；0.01；0.015；0.02；0.025；0.03；0.035搖勻0.2mol/LpH6.5磷酸緩沖液（mL）

18、40.5mol/L CaCl2（mL） 10.5mol/L NaOH（mL） 4混勻后，轉入10mL的離心管中，在2500r/min下離心5min，以0號作為對照，在A410nm波長下測光吸收值，并記錄光吸收值A410。以吸光值為橫坐標、對硝基苯酚的含量為縱坐標計算直線回歸方程y=a+bx及相關系數R，即對硝基苯酚含量n（?mol）=a+b×A410，通過計算得到回歸方程為：n（mol）=-0.0000+0.0594 A410,R=0.9992,R2=0.99（四）計算方法土壤酸性磷酸酶的活性用單位時間內每克土中的對硝基苯酚的微克數表示，即（?g/ h g W）=n×M&#

19、215;稀釋倍數/（W×t）式中： n標準曲線上查得樣品中對硝基苯酚的濃度（?mol）；M對硝基苯酚的相對分子質量（為139.11 單位是g/mol）；t 反應時間（h）； W樣品土壤的重量（g）土壤酸性磷酸酶測定(改進后)待測土樣風干，過80目篩。精確稱取0.200g土樣于10ml圓底塑料離心管中，加入0.2ml甲苯，振蕩搖勻。15分鐘后，加入4ml pH=6.5磷酸緩沖液，再加入1ml 0.05M對硝基苯磷酸二鈉溶液（以pH=6.5磷酸緩沖液配制），加蓋搖勻，于37培養1小時。取出后搖勻，加入1ml 0.5M氯化鈣溶液和4ml 0.5M氫氧化鈉溶液，振蕩搖勻，于2500r離心5分

20、鐘。吸取上清液5ml，于3800r離心5分鐘，于1小時內，在410nm下比色，記錄光吸收值。標準曲線的繪制：精確稱取0.0696g對硝基苯酚，定容至100ml，取10ml再次定容至100ml。則得到0.5umol/ml對硝基苯酚標準溶液。分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9ml對硝基苯酚標準溶液，對照組不吸取標準溶液，并定容至1ml，搖勻后加入4ml pH=6.5磷酸緩沖液、1ml 0.5M氯化鈣溶液和4ml 0.5M氫氧化鈉溶液，振蕩搖勻，于2500r離心5分鐘，再于3800r離心5分鐘。于1小時內，在410nm下比色，記錄光吸收值。以標準溶液濃度為橫

21、坐標，以光吸收值為縱坐標繪制標準曲線。脫氫酶活性測定（一）原理 該方法以2，3，5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）為基質，基質接受脫氫酶活化的酚，生成紅色的2，3，5-三苯基甲月替（TTF），該紅色溶液在485nm處有最大的吸收光值，根據甲月替的生成數量與紅色溶液的吸光度成正比來進行定量分析，采用的是TTC還原比色法。（二）步驟1.標準曲線的制作(1) 取一支大試管，用移液管移取0.2ml3%TTC溶液，再加入少量保險粉，搖勻，最后移取9.8ml甲醇溶液。試管內的混合液記為母液。(2) 取6支試管，按順序編號，并按表4加入試劑。 表4 TTC標準曲線配制表 試管號 0 1 2 3 4 5 6 6

22、00mg/ml TTF(ml) 0 0.25 0.35 0.5 0.75 1.0 1.25 TTF濃度(mg/ml) 0 15 21 30 45 60 75 甲醇(ml) 10 9.75 9.65 9.5 9.25 9.0 8.75 (3) 混勻后，比色，以0號作為對照，在485nm波長下測光吸收值，并記錄光吸收值A485。 (4) 以吸光值為橫坐標，TTF的濃度為縱坐標計算直線回歸方程y=a+bx及相關系數R，即TTF濃度C(mg/L)=a+b*A485,通過計算得到回歸方程為： C(mg/ml)=3.0605+75.4514*A485,R=0.9999,R2=0.99992.脫氫酶活性的測

23、定 (1)稱取風干土樣壤土0.5g、黏土0.5g、沙土1.0g于50ml的塑料離心管中，加入0.5ml 0.5%的葡萄糖溶液，混勻，再加入0.2ml 3%TTC溶液，混勻后在36-37攝氏度的培養箱中暗室培養24h。 (2)培養完成后，加2滴濃硫酸終止反應，再加入10ml甲醇，徹底混勻（蓋上蓋子，上下搖動）。 (3)而后轉入10ml塑料離心管中在2500r/min 下離心5min。 (4)取上清液在485nm 下比色，記錄吸收光值A485。（三）計算方法 土壤脫氫酶的活性用每克土中的TTF的微克數表示，即(mg/h g W)=C*V*稀釋倍數/(W*t) 式中：C標準曲線上查得樣品中TTF濃度

24、(mg/ml); V樣品反應的總體積(ml); t反應時間(h); W樣品土壤的重量(g)。土壤脫氫酶測定(實驗改進的)待測土樣風干，過80目篩。精確稱取0.200g土樣于10ml圓底塑料離心管中，加入0.25ml 0.5%葡萄糖溶液，振蕩搖勻，再加入0.1ml 3%紅四氮唑溶液，加蓋搖勻，于37培養24小時。取出后搖勻，滴加2滴濃硫酸，再加入5ml甲醇，振蕩搖勻，于2500r離心5分鐘。于1小時內，在485nm下比色，記錄光吸收值。土壤蔗糖酶活性測定1.原理 采用3,5-二硝基水楊酸比色法。該方法以蔗糖為基質，基質在土壤蔗糖酶作用下生成葡萄糖，葡萄糖和3,5-二硝基水楊酸反應生成橙黃色的3-

25、氨基-5-硝基水楊酸，并在508nm波長下有最大吸光值。2.測定方法 稱取壤土0.15g、砂土0.3g、粘土0.1g風干土于10mL離心管中，加入0.06 mL甲苯和1mL ph5.5 磷酸緩沖液，再加3mL 8%蔗糖溶液，搖勻后加蓋，放進3637的培養箱中進行培養24個小時； 培養完成后取出，搖勻，并于4000r/min離心5min； 取上層清液0.2ml于20ml玻璃管中，并加入0.5ml3,5-二硝基水楊酸，再立即將玻璃管沸水浴中加熱5min，加熱完畢后在自來水流下冷卻3min； 將顯色液體用蒸餾水稀釋到5ml，在508nm波長下比色，記錄吸光值。3.標準曲線的制作 取500mg真空干燥

26、的葡萄糖溶于100ml飽和苯甲酸溶液中（5mg葡萄糖/ml），即為標準葡萄糖溶液。再用標準葡萄糖溶液制0.01-0.05mg/ml的工作液。取1ml不同濃度的工作液，按測定蔗糖酶活性同樣的方法進行顯色，比色后以逛密度值為縱坐標，葡萄糖為橫坐標繪制標準曲線。4.計算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤中含葡萄糖的mg數表示。 葡萄糖(mg)=a×100 a從標準曲線查得的葡萄糖mg數 4換算系數蔗糖酶標準曲線的測定方法1.葡萄糖標準溶液的配制 a.飽和苯甲酸溶液的配制 在潔凈的燒杯中加入適量蒸餾水，慢慢加入少量苯甲酸同時用玻璃棒攪拌，直至苯甲酸溶解的同時出現析出的苯甲酸晶體為止。 b.標準葡

27、萄糖溶液的配制 稱取500mg葡萄糖溶解于適量苯甲酸飽和溶液中，并取100ml容量瓶用苯甲酸飽和溶液定容（5mg/ml）。2.操作步驟 a.取11支潔凈20ml玻璃管編號010。 b.按下表加液編號： 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 葡萄糖母液（ml） 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07飽和苯甲酸（ml） 0.2 0.195 0.19 0.185 0.18 0.175 0.17 0.16 0.15 0.14 0.13葡萄糖濃度（mg/ml） 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.0

28、3 0.04 0.05 0.06 0.07吸光值（A508nm） 0 0.05 0.117 0.227 0.31 0.392 0.49 0.666 0.839 1.006 1.176 c.在玻璃管中各加入0.5ml3,5-二硝基水楊酸溶液，并立刻放入沸水浴中加熱5min.加熱后，立刻將玻璃管在流動自來水下冷卻3min.冷卻完畢后，用蒸餾水定容至5ml. d.將顯色液在508nm波長下比色。最大吸收峰處的波長為500nm。一般情況下，選取最大吸收峰處的波長進行測定可以提高靈敏度，但在此波長下DNS 試劑也具有一定的吸光度(DNS 試劑- 水曲線) 。再者，實驗過程中，顯色之前空白和待測液中DNS

29、 試劑的添加量是相同的，但顯色期間由于部分DNS 試劑與待測液中還原糖相結合，從而造成測定吸光度時，空白中DNS 試劑含量大于待測液中DNS試劑含量。故5 0 0 n m 下，D N S 試劑對測定結果干擾嚴重。結合葡萄糖顯色液- 水曲線可以看出，這種影響在 540nm 的情況下一直很顯著。故本實驗DNS 試劑1最終確定的測定波長選為540nm，而不是500nm(最大吸收波長)。土壤酶活性測定方法（老方法較詳細）土壤脫氫酶活性測定 原理 氯化三苯基四氮唑（TTC）是標準氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲臢（TPF），TPF比較穩定，不會

30、被空氣中的氧自動氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋果酸得到增強，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標。 測定步驟 1 稱取4克鮮土于50ml三角瓶中，加入4mL（TTC-葡萄糖-Tris緩沖溶液（pH7.6，即2ml 1%TTC-Tris緩沖溶液，2ml 1%葡萄糖)，置37暗室培養24hr。 2 取出后用少量甲醇提取后過濾，再用50ml容量瓶或比色管定容。 3 濾液馬上用485nm波長下分光光度計測定。 附：pH7.6 Tris緩沖液的配制： A：0.2M 三-（羥甲基）-氨基

31、甲烷溶液（1000 ml含24.23克） B：0.2M HCl 100 ml A+76.8ml B,加水稀釋至400 ml，準確調節pH為7.6。 TPF標準曲線的制備：準確稱取10mg TPF溶于250 ml甲醇中，得到40 mg/L的母液。從中吸取0，1，2，3，4，5 ml于50ml容量瓶中，用甲醇定容，得到0，40，80，120，160，200ug TPF的標準曲線。 土壤脲酶的測定方法（苯酚鈉次氯酸鈉比色法）一、原理 脲酶存在于大多數細菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶作用是極為專性的，它僅能水解尿素，水解的最終產物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，與土壤的微生物數量、有機物質含量

32、、全氮和速效磷含量呈正相關。根際土壤脲酶活性較高，中性土壤脲酶活性大于堿性土壤。人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況。土壤中脲酶活性的測定是以脲素為基質經酶促反應后測定生成的氨量，也可以通過測定未水解的尿素量來求得。本方法以尿素為基質，根據酶促產物氨與苯酚次氯酸鈉作用生成藍色的靛酚，來分析脲酶活性。二、試劑1）甲苯2）10%尿素：稱取10g尿素，用水溶至100ml。3）檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）：184g檸檬酸和147.5g氫氧化鉀（KOH）溶于蒸餾水。將兩溶液合并，用1mol/LNaOH將PH調至6.7，用水稀釋定容至1000ml。4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于

33、少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀釋至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。將A、B溶液保存在冰箱中。使用前將A液、B液各20ml混合，用蒸餾水稀釋至100ml。5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩定。6）氮的標準溶液： 精確稱取0.4717g硫酸銨溶于水并稀釋至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的標準液；再將此液稀釋10倍（吸取10ml標準液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。三、操作步驟稱取5g土樣于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振蕩均勻，15min后加10ml 10%尿素溶液和20m

34、l PH 6.7檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后在37恒溫箱培養24小時。培養結束后過濾，過濾后取1ml濾液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。1h內在分光光度計與578nm波長處比色。（靛酚的藍色在1h內保持穩定）。標準曲線制作：在測定樣品吸光值之前，分別取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后補加蒸餾水至20ml。再加入4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。1h內在分光光度計上于578nm波長處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。注意事

35、項:1、每一個樣品應該做一個無基質對照，以等體積的蒸餾水代替基質，其他操作與樣品實驗相同，以排除土樣中原有的氨對實驗結果的影響。2、整個實驗設置一個無土對照，不加土樣，其他操作與樣品實驗相同，以檢驗試劑純度和基質自身分解。3、如果樣品吸光值超過標曲的最大值，則應該增加分取倍數或減少培養的土樣四、結果計算： 以24小時后1g土壤中NH3N的毫克數表示土壤脲酶活性（Ure）。Ure=（a樣品a無土a無基質）×V×nm式中：a樣品為樣品吸光值由標準曲線求得的NH3N毫克數； a無土為無土對照吸光值由標準曲線求得的NH3N毫克數； a無基質為無基質對照吸光值由標準曲線求得的NH3N

36、毫克數； V為顯色液體積；n為分取倍數，浸出液體積吸取濾液體積；m表示烘干土重土壤磷酸酶活性測定（磷酸苯二鈉比色法）一、原理測定磷酸酶主要根據酶促生成的有機基團量或無機磷量計算磷酸酶活性。前一種通常稱為有有機基團含量法，是目前較為常用的測定磷酸酶的方法，后一種稱為無機磷含量法。研究證明：磷酸酶有三種最適PH值：45、67、810。因此，測定酸性、中性和堿性土壤的磷酸酶，要提供相應的PH緩沖液才能測出該土壤的磷酸酶最大活性。測定磷酸酶常用的PH緩沖體系有乙酸鹽緩沖液（PH5.05.4）、檸檬酸鹽緩沖液（PH7.0）、三羥甲基氨基甲烷緩沖液（PH7.08.5）、和硼酸緩沖液（PH910）。磷酸酶測

37、定時常用基質有磷酸苯二鈉、酚酞磷酸鈉、甘油磷酸鈉、-或者-萘酚磷酸鈉等。現介紹磷酸苯二鈉比色法。二、試劑1）緩沖液：（1）醋酸鹽緩沖液（PH 5.0）0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸鈉溶液 16.4g C2H3O2Na或27g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和35.2ml 0.2mol/L 醋酸鈉溶液稀釋至1L.（2）檸檬酸鹽緩沖液（PH 7.0）0.1mol/L 檸檬酸溶液 19.2g C6H7O8溶至1L.0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液 53.63g Na2HPO4.7H2O或者71

38、.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L.取6.4ml 0.1mol/L 檸檬酸溶液加43.6ml 0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液稀釋至100ml.（3）硼酸鹽緩沖液（PH 9.6）0.05mol/L 硼砂溶液 19.05g 硼砂溶至1L.0.2mol/L NaOH溶液 8g NaOH溶至1L.取50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀釋至200ml.2）0.5% 磷酸苯二鈉（用緩沖液配制）3）氯代二溴對苯醌亞胺試劑：稱取0.125g氯代二溴對苯醌亞胺，用10ml 96%乙醇溶解，貯于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。4）

39、甲苯5）0.3%硫酸鋁溶液6）酚標準溶液 酚原液：取1g重蒸酚溶于蒸餾水中，稀釋至1L，存于棕色瓶中。 酚工作液（0.01mg/ml）：取10ml酚原液稀釋至1L。三、操作步驟稱5g土樣置于200ml三角瓶中，加2.5ml甲苯，輕搖15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二鈉（酸性磷酸酶用乙酸鹽緩沖液；中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液；堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液），仔細搖勻后放入恒溫箱，37下培養24h。然后在培養液加入100ml 0.3%硫酸鋁溶液并過濾。吸取3ml濾液于50ml容量瓶中，然后按繪制標準曲線方法顯色。用硼酸緩沖液時，呈現藍色，于分光光度計上660nm處比色。標準曲線繪制：取0、1、

40、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml硼酸緩沖液和4滴氯代二溴對苯醌亞胺試劑，顯色后稀釋至刻度，30min后，在分光光度計上660nm處比色。以顯色液中酚濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。注意事項:1、每一個樣品應該做一個無基質對照，以等體積的蒸餾水代替基質，其他操作與樣品實驗相同，以排除土樣中原有的氨對實驗結果的影響。2、整個實驗設置一個無土對照，不加土樣，其他操作與樣品實驗相同，以檢驗試劑純度和基質自身分解。3、如果樣品吸光值超過標曲的最大值，則應該增加分取倍數或減少培養的土樣四、結果計算 以24h后1g土壤中釋放出的酚的質量（mg）表示磷酸

41、酶活性。 磷酸酶活性=（a樣品a無土a無基質）×V×nm式中：a樣品為樣品吸光值由標準曲線求得的酚毫克數； a無土為無土對照吸光值由標準曲線求得的酚毫克數； a無基質為無基質對照吸光值由標準曲線求得的酚毫克數； V為顯色液體積；n為分取倍數，浸出液體積吸取濾液體積；m表示烘干土重土壤蔗糖酶活性測定（3,5- 二硝基水楊酸比色法）一、原理蔗糖酶與土壤許多因子有相關性，如與土壤有機質、氮、磷含量，微生物數量及土壤呼吸強度有關，一般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的還原糖與 3,5- 二硝基水楊酸反應而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與

42、還原糖量相關，因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。二、試劑1）酶促反應試劑：基質8%蔗糖，pH5.5磷酸緩沖液：1/15M磷酸氫二鈉（11.876g Na2HPO4·2H2O溶于1L蒸餾水中）0.5ml加1/15M磷酸二氫鉀（9.078g KH2PO4溶于1L蒸餾水中）9.5ml即成，甲苯2）葡萄糖標準液（1mg/mL） 預先將分析純葡萄糖置80烘箱內約12小時。準確稱取50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4保存期約一星期）。若該溶液發生混濁和出現絮狀物現象，則應棄之，重新配制。 3） 3,5- 二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）

43、 稱0.5g二硝基水楊酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸鉀鈉，用水稀釋定容至100ml（保存期不過7天）。三、操作步驟（1）標準曲線繪制分別吸1 mg/mL的標準葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于試管中，再補加蒸餾水至1mL，加DNS試劑3mL混勻，于沸水浴中準確反應5min（從試管放入重新沸騰時算起），取出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調零在波長540nm處比色，以OD值為縱坐標，以葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。（2）土壤蔗糖酶測定稱取5 g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml 8%蔗糖溶液，5ml pH 5.5磷酸緩沖液和

44、5滴甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37下培養24h。到時取出，迅速過濾。從中吸取濾液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml DNS試劑，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min，隨即將容量瓶移至自來水流下冷卻3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用蒸餾水稀釋至50ml，并在分光光度計上于508nm處進行比色。（為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無基質對照，整個試驗需做無土壤對照；如果樣品吸光值超過標曲的最大值，則應該增加分取倍數或減少培養的土樣。）四、結果計算：蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克數表示。蔗糖酶活性=（a樣品a無土a無基質）

45、5;nma樣品、a無土、a無機質分別表示其由標準曲線求的葡萄糖毫克數；n為分取倍數；m表示烘干土重土壤纖維素酶活性測定（3,5- 二硝基水楊酸比色法）一、原理纖維素是植物殘體進入土壤的碳水化合物的重要組分之一。在纖維素酶作用下，它的最初水解產物是纖維二糖，在纖二糖酶作用下，纖維二糖分解成葡萄糖。所以，纖維素酶是碳素循環中的一個重要的酶。纖維素酶解所生成的還原糖與 3,5- 二硝基水楊酸反應而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關，因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。二、試劑1）甲苯2）1%羧甲基纖維素溶液：1g 羧甲基纖維素鈉，用50%的乙醇溶至100ml。3

46、）pH5.5醋酸鹽緩沖液：0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸鈉溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸鈉溶液混勻即成PH 5.5醋酸鹽緩沖液.4）3,5-二硝基水楊酸溶液：稱1.25g二硝基水楊酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸鉀鈉，用水稀釋至250ml（保存期不過7天），5）葡萄糖標準液（1mg/mL） 預先將分析純葡萄糖置80烘箱內約12小時。準確稱取50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾

47、水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4保存期約一星期）。若該溶液發生混濁和出現絮狀物現象，則應棄之，重新配制。三、操作步驟葡萄糖標準曲線：分別吸1mg/mL的標準葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于試管中，再補加蒸餾水至1mL，加DNS溶液3ml混勻，于沸騰水浴中加熱5min，取出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調零在波長540nm處比色，以OD值為縱坐標，以葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。 稱10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，搖勻后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纖維素溶液和5ml pH5.5醋酸鹽緩沖液，將三角瓶放在37恒溫箱中培

48、養72h。培養結束后，過濾并取1ml濾液，然后按繪制標準曲線顯色法比色測定。（為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無基質對照，整個試驗需做無土壤對照；如果樣品吸光值超過標曲的最大值，則應該增加分取倍數或減少培養的土樣。） 四、結果計算纖維素酶活性以72h，1g干土生成葡萄糖毫克數表示。纖維素酶活性=（a樣品a無土a無基質）×nma樣品、a無土、a無機質分別表示其由標準曲線求的葡萄糖毫克數；n為分取倍數；m表示烘干土重過氧化氫酶活性測定（高錳酸鉀滴定法）一、原理過氧化氫廣泛存在于生物體和土壤中，是由生物呼吸過程和有機物的生物化學氧化反應的結果產生的，這些過氧化氫對

49、生物和土壤具有毒害作用。與此同時，在生物體和土壤中存有過氧化氫酶，能促進過氧化氫分解為水和氧的反應（H2O2 H2O+O2），從而降低了過氧化氫的毒害作用。土壤中過氧化氫酶的測定便是根據土壤（含有過氧化氫酶）和過氧化氫作用析出的氧氣體積或過氧化氫的消耗量，測定過氧化氫的分解速度，以此代表過氧化氫酶的活性。測定過氧化氫酶的具體方法比較多，如氣量法：根據析出的氧氣體積來計算過氧化氫酶的活性；比色法：根據過氧化氫與硫酸銅產生黃色或橙黃色絡合物的量來表征過氧化氫酶的活性；滴定法：用高錳酸鉀溶液滴定過氧化氫分解反應剩余過氧化氫的量，表示出過氧化氫酶的活性。本實驗重點采用高錳酸鉀滴定法。二、試劑2mol/L H2SO4溶液:量取5.43ml的濃硫酸稀釋至500ml，置于冰箱貯存;0.02mol/L高錳酸鉀溶液：稱取1.7g高錳酸鉀，加入400mL 水中，緩緩煮沸15min，冷卻后定容至500mL，避光保存，用時用0.1mol