1、分子熒光分析法基本要點：1. 理解分子熒光法的基本原理；2. 掌握分子熒光發射光譜的特；3. 了解熒光光譜儀的組成及各部分作用；4. 掌握分子熒光分析法的定量分析方法及主要應用范圍。發光光譜：物質分子或原子吸收輻射被激發后，電子以無輻射躍遷至第一電子激發態的最低振動能級，再以輻射的方式釋放這一部分能量而產生的光譜稱為 熒光、磷光。 根據物質接受的輻射能量的大小及與輻射作用的質點不同，熒光分析法可分為以下幾種：1. X 射線熒光分析法 用 X 射線作光源，待測物質的原子受激發后在很短時間內（10-8 s）發射波長在 X 射線范圍內的熒光。2. 原子熒光分析法： 待測元素的原子蒸氣吸收輻射激發后，

2、在很短的時間內（10-8 s），部分將發生輻射躍遷至基態，這種二次輻射即為熒光，根據其波長可進行定性，根據譜線強度進行定量。 熒光的波長如與激發光相同，稱為共振熒光。 熒光的波長比激發光波長長，稱為stokes熒光；若短，稱為反stokes熒光。3. 分子熒光分析法： 有些物質的多原子分子，在用紫外、可見光（或紅外光）照射時，也能發射波長在紫外、可見（紅外）區熒光，根據其波長及強度可進行定性和定量分析，這就是通常的（分子）熒光分析法。 基本原理一. 分子熒光的發生過程（一）分子的激發態單線激發態和三線激發態 大多數分子含有偶數電子，在基態時，這些電子成對地存在于各個原子或分子軌道中，成對自旋，

3、方向相反，電子凈自旋等于零：S=+(-)=0，其多重性 M=2S+1=1 (M 為磁量子數)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能級不受外界磁場影響而分裂，稱“單線態”；圖1 單線基態（A）、單線激發態（B）和三線激發態（C） 當基態分子的一個成對電子吸收光輻射后，被激發躍遷到能量較高的軌道上，通常它的自旋方向不改變，即S=0，則激發態仍是單線態，即“單線(重)激發態”； 如果電子在躍遷過程中，還伴隨著自旋方向的改變，這時便具有兩個自旋不配對的電子，電子凈自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3 即分子在磁場中受到影響而產生能級分裂，這種受激態稱為“三線(重)

4、激發態”；“三線激發態” 比 “單線激發態” 能量稍低。但由于電子自旋方向的改變在光譜學上一般是禁阻的，即躍遷幾率非常小，只相當于單線態 單線態過程的 10-610-7。（二）分子去活化過程及熒光的發生： （一個分子的外層電子能級包括 S0（基態）和各激發態S1，S2，.，T1.，每個電子能級又包括一系列能量非常接近的振動能級） 處于激發態的分子不穩定，在較短的時間內可通過不同途徑釋放多余的能量（輻射或非輻射躍遷）回到激態，這個過程稱為“去活化過程”，這些途徑為：1. 振動弛豫：在溶液中，處于激發態的溶質分子與溶劑分子間發生碰撞，把一部分能量以熱的形式迅速傳遞給溶劑分子（環境），在10-111

5、0-13 秒時間回到同一電子激發態的最低振動能級，這一過程稱為振動弛豫。圖2 分子吸收和發射過程的能級圖2. 內轉換：當激發態S2 的較低振動能級與S1 的較高振動能級的能量相當或重疊時，分子有可能從S2 的振動能級以無輻射方式過渡到S1 的能量相等的振動能級上， 這一無輻射過程稱為“內轉換”。 （“ 內轉換”過程同樣也發生在三線激發態的電子能級間） 3. 外轉換：激發態分子與溶劑分子或其他溶質分子相互作用（如碰撞）而以非輻射形式轉移掉能量回到基態的過程稱“外轉換” 。4.系間跨躍：當電子單線激發態的最低振動能級與電子三線激發態的較高振動能級相重疊時，發生電子自旋狀態改變的 ST 躍遷，這一過

6、程稱為 “系間跨躍” 。 （含有高原子序數的原子如 Br2、I2 的分子中，由于分子軌道相互作用大，此過程最為常見。）5. 熒光發射：當激發態的分子通過振動馳豫內轉換振動馳豫到達第一單線激發態的最低振動能級時，第一單線激發態最低振動能級的電子可通過發射輻射（光子）躍回到基態的不同振動能級，此過程稱為 “熒光發射”。 如果熒光幾率較高，則發射過程較快，需10-8秒。（它代表熒光的壽命）由于不同電子激發態（S）的不同振動能級相重疊時，內轉換發生速度很快（容易），在10-111013秒內完成，所以通過重疊的振動能級發生內轉換的幾率要比由高激發態發射熒光的幾率大的多，因此，盡管使分子激發的波長有短（l

7、1）有長（ l2 ），但發射熒光的波長只有l3（l1l2）。6. 磷光發射：第一電子三線激發態最低振動能級的分子以發射輻射（光子）的形式回到基態的不同振動能級，此過程稱為 “磷光發射”。 （磷光的波長l4較熒光的波長l3稍長，發生過程較慢 約 10-410s） 由于三線態 單線態的躍遷是禁阻的，三線態壽命比較長，（10-310s 左右），若沒其它過程同它競爭時，磷光的發生就有可能；由于三線態壽命較長，因而發生振動弛豫及外轉換的幾率也高，失去激發能的可能性大，以致在室溫條件下很難觀察到溶液中的磷光現象。因此，試樣采用液氮冷凍降低其它去活化才能觀察到某些分子的磷光。 總之：處于激發態的分子，可以通

8、過上述不同途徑回到基態，哪種途徑的速度快，哪種途徑就優先發生。 如果發射熒光使受激分子去活化過程與其他過程相比 較快，則熒光發生幾率高，強度大。 如果發射熒光使受激分子去活化過程與其他過程相比 較慢，則熒光很弱或不發生。（三）熒光量子效率：物質發射熒光的光子數與吸收激發光的光子數的比值。 (1) F 數值在 01 之間。他的大小取決于物質分子的化學結構及環境（t0c、pH 、溶劑等）。 二. 激發光譜與熒光（發射）光譜1. 激發光譜：將激發熒光的光源用單色器分光，連續改變激發光波長，固定熒光發射波長，測定不同波長激發光下物質溶液發射的熒光強度(F)，作Fl光譜圖稱激發光譜。 從激發光譜圖上可找

9、到發生熒光強度最強的激發波長lex，選用 lex可得到強度最大的熒光。2. 熒光光譜：選擇lex作激發光源，用另一單色器將物質發射的熒光分光，記錄每一波長下的 F，作 F- l 光譜圖稱為熒光光譜。 熒光光譜中熒光強度最強的波長為 lem 。lex 與 lem一般為定量分析中所選用的最靈敏的波長。 三. 熒光與分子結構的關系 1. 分子結構與熒光 具有 p、 p 及 n、 p 電子共軛結構的分子能吸收紫外和可見輻射而發生 p -p* 或 n - p* 躍遷，然后在受激分子的去活化過程中發生 p*- p或 p*- n 躍遷而發射熒光。 發生 p - p* 躍遷分子，其摩爾吸光系數（）比 n -

10、p* 躍遷分子的大1001000倍，它的激發單線態與三線態間的能量差別比 n - p* 的大的多，電子不易形成自旋反轉，體系間跨越幾率很小，因此， p - p* 躍遷的分子，發生熒光的量子效率高，速率常數大，熒光也強。 所以只有那些具有 p- p 共軛雙鍵的分子才能發射較強的熒光； p 電子共軛程度越大，熒光強度就越大（ lex與 lem長移）大多數含芳香環、雜環的化合物能發出熒光，且 p 電子共軛越長， F 越大。 2. 取代基對分子發射熒光的影響（1）（苯環上）取代 給電子基團，使 p 共軛程度升高熒光強度增加：如CH3，NH2 ，OH ，OR等。（2） (苯環上）取代吸電子基團，時熒光強

11、度減弱甚至熄滅：如： ，COOH ，CHO， NO2 ，N=N。（3）高原子序數原子，增加體系間跨越的發生，使熒光減弱甚至熄滅。如：Br，I 。3. 共面性高的剛性多環不飽和結高的分子有利于熒光的發射。例如：熒光素呈平面構型，其結構具有剛性，它是強熒光物質；而酚酞分子由于不易保持平面結構，故而不是熒光物質。 溶液的熒光強度一.熒光強度與溶液濃度的關系 熒光是由物質吸收光能后發射而出，因此，溶液的熒光強度 F 和溶液吸收光能的程度以及物質的熒光頻率有關： F （I0-It） F = K（I0-It） (2) K 為常數，取決于熒光物質的量子效率F，根據LB定律： 所以 F = K ( I0-I0

12、10-ebc) = K I0 ( 1-10-ebc) = K I0 ( 1-e-2.303ebc ) (3) 將式中 e-2.303ebc 展開，得 (4) 當 2.303ebC 0.05 時(濃度很小，溶液較稀時)，上式括號內第一項以后的各項均可忽略不計，所以： F = KI02.303ebc （5） 對于一熒光物質的稀溶液，當 I0 及 b 一定時，F = Kc （6） 即在低濃度（2.303ebc 0.05）時，溶液的熒光強度與熒光物質的濃度呈（線性）正比關系。二. 定量分析方法 1. 工作曲線法： 配制一系列濃度梯度的待測物的標準溶液，同空白溶液，使樣經過相同的處理之后分別測定熒光強度

13、：Fs、F0、Fx，然后作（ Fs - F0） c 曲線，根據（FxF0)，從工作曲線上求得待測物的濃度（或含量）。 2. 直接比較法 ： 如果熒光物質溶液的工作曲線通過原點，就可選擇其線性范圍，用直接比較法進行測定： FsF0 = KcS ， FxF0 = Kcx （7）三. 影響熒光強度的外界因素 1. 激發光源：一般選用lex 最大 但對某些易感光、易分解的熒光物質，盡量采用長波長，低 I0 及短時間光照 2. 溫度：大多數分子在溫度升高時，分子與分子之間，分子與溶劑分子之間的碰撞頻率升高，非輻射能量轉移過程升高，F 降低，因此，降低溫度，有利于提高 F 。 3. 溶液的 pH：帶有酸性

14、或堿性環狀取代基的芳香組化合物的熒光一般都與 pH 值有關，有些化合物在離子狀態時不顯熒光。為此，在用熒光強度進行定量測定時，嚴格控制溶液 pH值是非常重要的。4. 溶劑：對共軛的熒光物質在極性溶劑中，E 減小 躍遷幾率升高 F（波長長移）溶劑粘度 F5. 內濾：當熒光波長與熒光物質或其它物質的吸收峰相重疊時，將發生自吸收使熒光物質的熒光強度下降，此現象稱 “內濾” 。6. 散射光的影響（溶劑的二種散射）（1）瑞利散射光：物質（溶劑或其它分子）分子吸收光能后，躍遷到基態的較高振動能級，在極短時間（10-12s）返回到原來的振動能級并發出和原來吸收光相同波長的光，這種光稱為瑞利散射光。（2）拉曼

15、散射光：物質分子吸收光能后，若電子返回到比原來能極稍高（或稍低）的振動能級而發射的光稱為拉曼散射光。 瑞利散射光波長與激發光波長相同，拉曼散射與激發光波長不同，而熒光物質的熒光波長與激發光波長無關，因此可以通過選擇適當的激發波長將拉曼散射光與熒光分開。7. 熒光熄滅劑的影響： 熒光熄滅：熒光物質分子與溶液中其它物質分子之間作用導致熒光強度降低的現象。 熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質。如：X-，重金屬離子、O2 、硝基化物質、重氮化合物等。 尤其是溶液中的溶解氧能引起幾乎所有的熒光物質產生不同程度的熒光熄滅現象，因此，在較嚴格的熒光實驗中必須除O2 。8. 表面活性劑的影響：提高熒光強度。 測量

16、熒光的儀器 熒光計、熒光分光光度計的基本組成部件：激發光源、樣品池、單色器、檢測器、顯示系統。1. 激發光源：要比吸收法中光源強度大。 汞燈：提供線光譜（光源強度隨l變化大） 碘鎢燈：提供連續光譜 300700nm. 氙燈：提供連續光譜250700nm，300400nm 段強度相近。 激光：發光強度大，能極大地提高熒光分析的靈敏度。2. 樣品池：通常用石英材料制成長方體形（方形），（散射光較少），低溫熒光測定時在一樣品池外套一個液氮的透明石英真空瓶。3. 單色器：熒光計兩個濾光片。 第一濾光片：在光源與樣品池之間，濾去不需要的光讓需要的激發光通過。 第二濾光片：在樣品池與檢測器之間，濾去溶劑散

17、射光，容器表面散射光，雜質發出的光等，讓待測物質發射的熒光通過。熒光分光光度計兩個光柵（位置同濾光片）單色性好。4. 檢測器：因熒光通常較弱，采用光電倍增管作檢測器，靈敏度高。5. 顯示系統：光度表、計算機操作系統等 應用與示例一.無機化合物的熒光分析 無機化合物除了鈉鹽等少數例外，一般不顯示熒光。但很多金屬或非金屬離子可以與一有p電子共軛結構的有機化合物形成有熒光的化合物后，用熒光法測定： 1. 直接分析法：形成配（鰲）合物 元素：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Ge、Hf、Mg、Nb、Pb、Rh、Ru、S、Se、Sn、Si、Ta (鉭)、Th(釷)、Te、W、Zn、Zr 等。常用有機熒光試劑：8-羥基喹啉，安息香、茜素紫醬R，黃酮醇，二苯乙醇酮等。二. 有機化合物的熒光分析 熒光分析法主要應用于有機物、生化物質、藥物的測定（200多種）；包括有機化合物如：多環胺類、萘酚類、吲哚類、多環芳烴、氨基酸、蛋白質等。 藥物如：嗎啡、喹啉類、異喹啉類、麥角堿、麻黃堿 等。 維生素如：維生素A、B1、B2、B6、B12、E、C、葉酸 等。甾體、抗生素、酶、輔酶 等。 常見熒光試劑：熒胺 脂肪族或芳香族伯胺類； 鄰苯二甲醛(OPA) 伯胺類及大