1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ZmHSD基因轉(zhuǎn)化玉米自交系糖皮質(zhì)激素是一類動(dòng)物激素， 參與糖、 脂肪和蛋白質(zhì)的生物 合成和代謝等過程，還具有抗炎的作用1。11B -羥基類固醇脫 氫酶(11 B -hydroxysteroid dehydrogenase , 11 B -HSD)是調(diào) 節(jié)糖皮質(zhì)激素的關(guān)鍵酶， 它促進(jìn)活性糖皮質(zhì)激素與非活性激素之 間的相互轉(zhuǎn)換 2，3。雖然目前在植物中還沒有鑒定出 11B -HSD， 但是隨著擬南芥基因組測(cè)序工作的完成，發(fā)現(xiàn)了八個(gè)類似HSD的基因。最先鑒定出的是一種油菜籽 HSD它在利用ABA類似物抑 制種子萌發(fā)的過程中過量表達(dá) 4 ；Jolivet 等5 證實(shí)在芝麻和 油料作物中只

2、存在微量的 HSD這些HSD編碼的蛋白表現(xiàn)出與 NADP所依賴的11 B -HSD 17 B -HSD/17 B -類固醇脫氫酶相同的 性能。AtHSD1基因包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，它編碼的 蛋白由389個(gè)氨基酸組成，李鳳玲等7將AtHSD1的cDNA連接 到35S啟動(dòng)子后整合到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株明顯比野生株 粗壯，其分支和長(zhǎng)角果的數(shù)量也明顯增多，轉(zhuǎn)AtHSD1基因植株的表型與過量產(chǎn)生BR或過量表達(dá)BR受體基因BRI1的表型一致 810;同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性比野生植株高 7。因此， 該基因在改善農(nóng)作物植株生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量方面有很大的潛力。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，嘗試將

3、 ZmHSD基 因轉(zhuǎn)入玉米自交系品種， 以期獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株， 拓寬玉米種 質(zhì)的遺傳背景，為高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)玉米品種的選育服務(wù)。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料1.1.1 植物材料玉米( Zea maysL. )自交系 18-599 、齊 319 和昌 7-2 。1.1.2目的基因、載體、菌株 ZmHSD表達(dá)載體由山東農(nóng)業(yè) 大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。 表達(dá)載體中， 目的基因 為ZmHSD,其啟動(dòng)子為Ubi ;篩選標(biāo)記基因?yàn)?NPTI，其啟動(dòng)子 為CaMV35(圖1)。本研究所用質(zhì)粒為 PZP211,大腸桿菌菌株 為DH5況，農(nóng)桿菌菌株為 LBA44041.2 試驗(yàn)方法1.2.1培養(yǎng)基在N6改

4、良培養(yǎng)基11的基礎(chǔ)上，添加 0.25mg/L Na2MnO3 0.025 mg/L CuSO4 5H2O 和 0.025 mg/LCoCl2 6H2O1.2.2 幼胚愈傷組織受體系統(tǒng)參照孫慶泉等 11 的方法，取 幼胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，2425 C暗培養(yǎng)，繼代，選擇誘口型 愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體。1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與活化：將低溫保存的農(nóng)桿菌菌種LBA4404接種到添加25 mg/L Spe的YEB固體培養(yǎng)基平板上，挑取單菌落 接種于含 25 mg/L Spe 的 YEB 液體培養(yǎng)基中，置于搖床上預(yù)活 化(28C, 200 r/min )，取預(yù)活化的菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期

5、備 用。 愈傷組織浸染： 浸染前將新培養(yǎng)的菌液離心沉淀菌體， 用 液體N6培養(yǎng)基重懸，并稀釋到所需0D值。將型愈傷組織分離 成米粒大小的小塊， 投放到稀釋好的菌液中浸染。 用滅菌的濾紙 吸干愈傷表面的菌液， 并將其擺放到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng) 3 d， 用頭孢水洗菌。將洗好的愈傷放到恢復(fù)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)。 抗性愈傷的篩選、 分化和再生： 恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織依 次轉(zhuǎn)移到 1次、2次、3 次篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行抗性篩選，篩選 劑為巴龍霉素。將篩選后存活的愈傷轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上分化成 苗。分化苗苗高45 cm時(shí)轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基上。當(dāng)苗適度生 根后轉(zhuǎn)到基質(zhì)（基質(zhì)：蛭石=1 ： 1）中。成活植株轉(zhuǎn)到大田隔

6、離 區(qū)。1.2.4轉(zhuǎn)基因植株的PCR僉測(cè)CTAB法提取基因組DNA對(duì)轉(zhuǎn) 化植株、陽(yáng)性對(duì)照（質(zhì)粒）和陰性對(duì)照（未轉(zhuǎn)化植株）進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，檢測(cè)對(duì)象為目的基因 ZmHSD和標(biāo)記基因NPTI。根據(jù)已 知的ZmHSD基因序列，利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)ZmHSDI 的引物，上游引物在啟動(dòng)子內(nèi)部，下游引物在編碼區(qū)內(nèi)，S：CACGATTCTTCCTCGGCTC， CTAC：T TGCTACTCCTTCCTTTCCTG；GCT 標(biāo)記基因 NPTI 的弓I物為 S: GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG AGCTCTTCAGCAATATCACGGG引物由上海生工生物工

7、程公司合 成。用25卩l(xiāng) PCF反應(yīng)體系。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94C預(yù)變性5 min;94C變性1 min , 59C退火50 s , 72C延伸50 s , 35個(gè)循環(huán)； 72C終延伸10 min ; 4C保存。1%瓊脂糖凝膠、1%TBEt泳緩沖液電泳，溴化乙錠染色，紫外分析，拍照。2 結(jié)果與分析2.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲得將玉米幼胚（授粉后1015 d ）接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘 導(dǎo)出胚性愈傷組織（圖 2-1 ，2-2 ，2-3 ）；將經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后的 愈傷（圖 2-4 ），恢復(fù)培養(yǎng) 1 周，愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)有所改善， 轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基篩選， 1 輪后有些愈傷開始變褐， 3 輪后大部分 未轉(zhuǎn)化愈傷褐化死

8、亡， 愈傷組織上出現(xiàn)的小塊鮮活愈傷組織突起 基本上為抗性愈傷，抗性愈傷在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)正常（圖2-5 ） ；將經(jīng)過 3輪篩選的愈傷轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，25 d后愈傷表面開始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)， 之后綠色芽點(diǎn)逐漸分化成巴龍抗 性苗（圖 2-6 ）；將幼苗轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基上（圖 2-7），使 苗生根，期間有少量白化苗出現(xiàn)； 待苗長(zhǎng)出 2 3條根、高約 10 15 cm時(shí)，打開封口膜，煉苗 5 d后移栽花盆 （圖2-8） ; 3周 后移栽轉(zhuǎn)基因隔離區(qū)，開花期進(jìn)行人工自交結(jié)實(shí)（圖 2-9 ）；最 終獲得轉(zhuǎn)基因種子（圖 2-10 ）。2.2 轉(zhuǎn)基因植株分子檢測(cè)221目的基因ZmHSD的PCR檢測(cè)利用

9、ZmHSDl物對(duì)抗性 苗基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，有33株抗性苗出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照一 致的 444 bp 的特異性擴(kuò)增條帶（圖 3），表明該 33株轉(zhuǎn)基因植 株已將外源基因整合到基因組中。2.2.2標(biāo)記基因NPTH的PCR檢測(cè)對(duì)已知陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的 基因組DNA進(jìn)行標(biāo)記基因NPT 的PCR擴(kuò)增，均得到與陽(yáng)性對(duì) 照一致的 650 bp 的特異性擴(kuò)增條帶（圖 4），表明目的基因 PCR 檢測(cè)的陽(yáng)性株也全為標(biāo)記基因陽(yáng)性株。 對(duì)標(biāo)記基因的檢測(cè)可以排 除玉米基因組中ZmHSD基因的干擾。3 結(jié)論3個(gè)供試玉米自交系 18-599 、齊 319和昌 7-2 的幼胚都能誘 導(dǎo)產(chǎn)生H型愈傷組織，其中18-599所獲愈傷組織質(zhì)量好、數(shù)量 多，適于大量轉(zhuǎn)化；齊 319 和昌 7-2 愈傷顆粒松散、質(zhì)量不高， 尤其是昌 7-2 ，胚性愈傷數(shù)量較少。經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化共得到899株轉(zhuǎn)化株，通過PCR僉測(cè)初步證明 有 33株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株， 其中