1、PCR技術及應用分子生物學診斷組 江楊華 2019年3月25日 星期五l PCR的定義l PCR的原理l PCR反應體系的的成分及其作用l PCR反應體系的優化l PCR技術的特點l PCR產物的檢測方法l PCR技術在臨床檢驗中的應用 一、PCR的定義lPCRpolymerase chain reaction) ： 聚合酶鏈式反應，又稱體外DNA擴增技術。是近年來發展起來的一種體外擴增DNA片段的技術。l PCR技術是由美國 的Kary Mullis 于1985年發明，用此方法可以將微量目的DNA片段擴增一百萬倍以上。由于PCR方法帶來的革命性作用，Kary Mullis 本人因此獲1993

2、年諾貝爾化學獎。二、PCR技術的原理 PCR技術，其原理是模擬天然DNA的復制過程：以擬擴增的DNA分子為模板，在DNA聚合酶的作用下，以一對分別與模板5末端和3末端互補的引物寡核苷酸片段引導下，按照半保留復制的機制合成新的子鏈DNA的過程，重復這一過程，即可使目的DNA片段得到不斷的擴增。二、PCR技術的原理 PCR反應主要分為三個步驟：變性、退火、延伸。1.變性 (Denaturation)： 加熱使模板DNA雙鏈堿基間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈的過程。溫度一般為90-95度。2. 退火 (復性) (Annealling): 溫度降低后，變性后的DNA與引物按堿基配對原則互補結合的過程。溫度

3、一般為Tm-5度。二、PCR技術的原理 3. 延伸 (Extension): 在適宜溫度下，在DNA聚合酶作用下，以4種 dNTPs等為 原料，從引物的 3 端開始，結合單核苷酸，形成與模板鏈互補的新DNA鏈的過程。 耐熱DNA聚合酶最適溫度為72 。 上述 3 步為一個循環，每經過一個循環，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板，經過35個循環后，理論上DNA的量可達到235倍。 PCR 的基本反應步驟的基本反應步驟變性變性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C第第n次循環次循環二、PCR技術的原理1. 緩沖液：緩沖液： 10 50 mM Tris- Cl (pH8.

4、4)： 維持維持 Taq 酶作用環境酶作用環境的偏堿性的偏堿性 25 50 mM KCl： 促進引物退火，促進引物退火，50 mM 會抑制會抑制 Taq 酶的活性。酶的活性。 100g / ml 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 (BSA)： 對酶有一定的保護對酶有一定的保護性，如質量不好將起相反的作性，如質量不好將起相反的作 用，建議使用乙酰化的用，建議使用乙酰化的 BSA。明膠、。明膠、Tween-20、 二硫蘇糖醇二硫蘇糖醇 (DTT) 也有類也有類似作用。似作用。三、PCR反應體系的的成分及其作用 2. MgCl2 ： Taq 酶具有酶具有 Mg2+依賴性，顯著影依賴性，顯著影響反應的特異性和

5、擴增片段的產量，濃度一響反應的特異性和擴增片段的產量，濃度一般為般為1.5 2.0 mM，濃度過高能增加非特異，濃度過高能增加非特異擴增并影響產率，過低則酶活性顯著下降。擴增并影響產率，過低則酶活性顯著下降。 3. dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP。濃度一般為濃度一般為0.05 0.2 mM。 過高能加快反過高能加快反應速度，但可增加堿基的錯誤摻入應速度，但可增加堿基的錯誤摻入 率和室驗率和室驗成本。成本。 過低則反應速度下降，但可提高實驗過低則反應速度下降，但可提高實驗的精確性。的精確性。三、PCR反應體系的的成分及其作用 4. 引物引物 (Primer)：是一段寡

6、核苷酸片段，即：是一段寡核苷酸片段，即預擴增核酸片段兩端的已知序列。濃度一般預擴增核酸片段兩端的已知序列。濃度一般為為0.2 1 uM，偏高：非特異產物擴增及錯，偏高：非特異產物擴增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產量降配，增加引物之間形成引物二聚體，產量降低。低。 偏低：產量降低。偏低：產量降低。 5. Taq DNA 聚合酶：耐高熱，最初從火山口聚合酶：耐高熱，最初從火山口細菌中提取，具有連接酶活性和細菌中提取，具有連接酶活性和5 端至端至 3端端的外切酶活性。目前市售的均為克隆表達產的外切酶活性。目前市售的均為克隆表達產物。物。三、PCR反應體系的的成分及其作用 6. 模板模板DNA

7、 (Template): 可以是可以是DNA，也可以是，也可以是RNA，RNA的擴增首的擴增首先需逆轉錄成先需逆轉錄成cDNA后才能進行正常的后才能進行正常的PCR循循環。環。 待擴增的核酸需部分純化，使核酸標本中不含待擴增的核酸需部分純化，使核酸標本中不含蛋白酶、核酸酶、蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑以及能聚合酶抑制劑以及能與與DNA結合的蛋白質。結合的蛋白質。 模板的量一般微克水平或模板的量一般微克水平或102 105 拷貝，拷貝， 過過高會引起非特異產物的增加；高會引起非特異產物的增加； 過低則產量降過低則產量降低。低。 7. 水：水： 去離子水，補足整個反應體積。去離子水，補足整個

8、反應體積。三、PCR反應體系的的成分及其作用 10buffer： 130 / 10 = 3l MgCl2: 1.530 / 25 = 1.8l dNTPs: 0.230 / 10 = 0.6l 引物引物 P： 0.4302 / 10 = 2.4l Taq 酶酶(5U/l)：1 / 5 = 0.2l 模板：模板： 1l 水：水： 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21lPCR反應體系：反應體系：30ul 四、四、PCR反應條件優化：反應條件優化： 1、溫度、循環參數：、溫度、循環參數： 變性溫度和時間：變性溫度和時間： 保證模板保證模板DNA解鏈完全是保證整個解鏈完全是保證整個PCR

9、擴增成功的關鍵。擴增成功的關鍵。 加熱加熱9095，30 60 s，再復雜，再復雜的的DNA分子也可變性為單鏈。根據模板分子也可變性為單鏈。根據模板DNA復雜程度，可以調整變性溫度和時復雜程度，可以調整變性溫度和時間。一般情況下選擇間。一般情況下選擇94 30 ，可使各，可使各種復雜的種復雜的DNA分子完全變性。分子完全變性。 溫度過高或高溫持續時間過長，可溫度過高或高溫持續時間過長，可對對Taq酶活性和酶活性和dNTP分子造成損害。分子造成損害。四、四、PCR反應條件優化：反應條件優化： 復性溫度和時間：復性溫度和時間： PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與擴增特異性取決于復性過程中引物與

10、模板模板 的結合。的結合。 復性溫度的選擇，可根據引物的長度和復性溫度的選擇，可根據引物的長度和G+C含量確定，長度在含量確定，長度在15 25 bp 之間時，復之間時，復性溫度性溫度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 計算得到，一般計算得到，一般位于位于40 60，30 60 s。 復性溫度越高，產物特異性越高。復性復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。溫度越低，產物特異性越低。 一般情況下選擇一般情況下選擇55 30，足以使引物與，足以使引物與模板之間完全結合。模板之間完全結合。四、四、PCR反應條件優化：反應條件優化： 延伸溫度和時間：延伸溫度和時間： 一

11、般位于一般位于Taq酶最適作用溫度酶最適作用溫度70 75 之間。之間。 引物小于引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引利于引 物與模板的結合，可以緩慢升溫到物與模板的結合，可以緩慢升溫到70 75 。 延伸反應時間，可根據待擴增片段的長延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，度而定， 1Kb需加長延需加長延伸時間，伸時間，10Kb片段延伸時間可達片段延伸時間可達15分鐘。分鐘。 延伸時間過長可出現非特異擴增，常用延伸時間過長可出現非特異擴增，常用72 1。 四、四、PCR反應條件優化：反應條件優化： 循環數：循環數： 其他參數選定后，其他參數選定后，PC

12、R循環次數主要取循環次數主要取決于模板決于模板DNA的濃度。的濃度。 理論上說理論上說25 30次循環后，次循環后，PCR產物的產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到反應的產率不可能達到100%，因此不管模，因此不管模板濃度是多少，板濃度是多少，30 35次是比較合理的循次是比較合理的循環次數。環次數。 循環次數越多，非特異擴增增加。循環次數越多，非特異擴增增加。PCR擴增的特點基線期、指數期、平臺期PCR程序四、四、PCR反應條件優化：反應條件優化：2、PCR反應體系成分的優化反應體系成分的優化 MgCl2濃度：濃度： 1.5

13、2.0 mM 模板：模板： dNTP： 0.05 0.2 mM 引物：引物： 0.2 1 M 注：引物設計總原則是提高擴增的效注：引物設計總原則是提高擴增的效率和特異性。率和特異性。 引物設計原則引物設計原則 長度長度1530 b，過短特異性降低，過長則成，過短特異性降低，過長則成本增加，產量也下降。本增加，產量也下降。 引物堿基盡可能隨機分布，避免出現嘌呤、引物堿基盡可能隨機分布，避免出現嘌呤、嘧啶堆積現象，引物嘧啶堆積現象，引物 G+C 含量宜在含量宜在45 55%左右。左右。 引物內部不能含有自身互補序列，否則會形引物內部不能含有自身互補序列，否則會形成發夾樣二級結構，兩個引物之間尤其在

14、成發夾樣二級結構，兩個引物之間尤其在 3 末端不應有互補鏈存在，不然會形成引物二末端不應有互補鏈存在，不然會形成引物二聚體。聚體。引物設計原則引物設計原則 引物的堿基順序不應與非擴增區域有同源性引物的堿基順序不應與非擴增區域有同源性(70%)或少于連續或少于連續8個的互補堿基。要求在引個的互補堿基。要求在引物設計時采用計算機進行輔助檢索分析。物設計時采用計算機進行輔助檢索分析。 引物的引物的 5 末端堿基：并沒有嚴格的限制，只末端堿基：并沒有嚴格的限制，只要與模板要與模板DNA結合的引物長度足夠，其結合的引物長度足夠，其 5 末末端堿基可以不與模板端堿基可以不與模板DNA匹配呈游離狀態。匹配呈

15、游離狀態。最多可游離最多可游離10個堿基并不影響個堿基并不影響PCR反應進行反應進行。引物設計原則引物設計原則 引物的引物的 3 末端堿基：原則上要求引物末端堿基：原則上要求引物的的3末端與模板末端與模板DNA一定要配對，另外一定要配對，另外 3末端的末位堿基在很大程度上影響著末端的末位堿基在很大程度上影響著 Taq 酶的延伸效率。酶的延伸效率。 引物引物3末端堿基在末端堿基在錯誤配對時不同堿基的引發效率存在很錯誤配對時不同堿基的引發效率存在很大差異，最好選大差異，最好選T、G、C，而不選，而不選A。引物設計軟件：引物設計軟件：Primer7.0、Oligo6.0五、PCR技術的特點l 高度靈

16、敏l 高特異性l 簡便快捷1、凝膠電泳分析法： 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳2、分子雜交：基因芯片和原位雜交3、限制性內切酶酶切分析：點突變4、測序5、Real-time PCR：不是對PCR終產物進行檢測六、六、PCR產物的檢測方法產物的檢測方法Real-time實時熒光定量） PCR原理：所謂實時熒光定量原理：所謂實時熒光定量PCR技術，是指在技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用反應體系中加入熒光基團，利用 熒光信號積累實時監測整個熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知量模板進進程，最后通過標準曲線對未知量模板進 定量分析的方法。定量分析的方法。檢測方法

17、：檢測方法：1.SYBRGreen法法: 在在PCR反應體系中，加入過量反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入熒光染料特異性地摻入 DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光染料分子不會發射任何熒光 信號，從而保證熒光信號的增加與信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。產物的增加完全同步。 注：注：PCR產物熔解曲線圖產物熔解曲線圖(單一峰圖表明單一峰圖表明PCR擴增產物的單一性擴增產物的單一性)2.TaqMan探針法單鏈探針法單鏈DNA探針）探針）: 探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，擴增時，Taq 酶的酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離， 從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分鏈，就有一個熒光分子子 形成，實現了熒光信號的累積與形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。產物的