1、第三章第三章 酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化 電泳電泳electrophoresis, EPelectrophoresis, EP） ：指：指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷性質帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷性質相反的電極方向移動的過程。相反的電極方向移動的過程。 電泳技術是根據各種帶電粒子在電場電泳技術是根據各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質進行分離的實中遷移速度的不同而對物質進行分離的實驗技術。驗技術。第四節第四節 電電 泳泳一、電泳的基本理論一、電泳的基本理論 1. 1. 原理原理: : 在一定在一定pH條件下用條件下用buffer），不同大小、），不同大小、形狀及帶電顆

2、粒在電場中的移動速度不同用遷形狀及帶電顆粒在電場中的移動速度不同用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。密的泳動帶。 +- 影響遷移率的因素：影響遷移率的因素： 顆粒性質：顆粒性質：Q越大、越大、r越小、形狀越接近球形，越小、形狀越接近球形，v 越快。越快。 電場強度：電場強度：E越高，越高，v越快。越快。 電泳液：電泳液： pH值：離值：離pI越遠，越遠，v越快。（用越快。（用buffer保持保持恒定）恒定） 離子強度：離子強度越高，離子強度：離子強度越高，v 越低。越低。 通常，緩沖液離子強度在通常，緩沖液離子強度在0.02-0.

3、2之之間。間。 電電 滲：在電場中，液體對于固體支持物滲：在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。的相對移動。 應避免用高電滲物質作支持介質。應避免用高電滲物質作支持介質。 自由界面電泳：又稱移動界面電泳，自由界面電泳：又稱移動界面電泳，指在沒有支持介質的溶液中進行的電指在沒有支持介質的溶液中進行的電泳。泳。 區帶電泳區帶電泳: :指有支持介質的電泳，待指有支持介質的電泳，待分離物質在支持介質上分離成若干區分離物質在支持介質上分離成若干區帶。帶。 支持介質的作用支持介質的作用: :防止電泳過程防止電泳過程中的對流和擴散。中的對流和擴散。2. 2. 電泳的分類電泳的分類按支持介質種類的不同，區帶

4、電泳可分為：按支持介質種類的不同，區帶電泳可分為：紙電泳：用濾紙作支持介質，用于核苷酸定性定量分析。紙電泳：用濾紙作支持介質，用于核苷酸定性定量分析。醋酸纖維素薄膜電泳：常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，醋酸纖維素薄膜電泳：常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。優點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 以上兩種類型的電泳，由于介質的孔徑度大，沒有分子篩效以上兩種類型的電泳，由于介質的孔徑度大，沒有分子篩效應，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。應，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。 瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳： 一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝

5、膠孔徑度較大，對一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質只有很小的分子篩效應。大部分蛋白質只有很小的分子篩效應。聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳： 用于核酸和蛋白質的分離、純化及檢測。分辨率高。用于核酸和蛋白質的分離、純化及檢測。分辨率高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質。 3. 電泳常用設備 （1電泳儀 ：提供穩定直流電源的裝置 。 常壓電泳儀600V） 高壓電泳儀3000V） 超高壓電泳儀30000V50000V）（2電泳槽： 自由界面電泳槽 管狀電泳槽 板狀電泳槽（3附屬設備： 二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

6、！二、聚丙烯酰胺凝膠電泳！ 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種電泳方法。的一種電泳方法。 1.1.原理原理 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體體AcrAcr和交聯劑和交聯劑N N，N-N-甲叉雙丙甲叉雙丙烯酰胺烯酰胺BisBis在催化劑和加速劑作用在催化劑和加速劑作用下聚合的。下聚合的。CH2=CHCH2=CHC=OC=ONH2NH2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH2 CH2 NH NH C=O C=

7、O CH2=CH CH2=CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O C=O C=O NH2 NH NH2 NH CH2 CH2 NH NH C=O C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH2 NH NH2丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺AcrBis 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種： 1化學催化系統：化學催化系統：AP-TEMED 催化劑：過

8、硫酸銨催化劑：過硫酸銨ammonium persulfate，AP） 加速劑：加速劑：TEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺）四甲基乙二胺） 2光催化系統：核黃素光（光催化系統：核黃素光（TEMED） 催化劑催化劑: 核黃素維生素核黃素維生素B2） 引發劑引發劑: 光光 TEMED的存在，可加速聚合。的存在，可加速聚合。 . 凝膠濃度越大?。?，孔徑越小大），凝膠濃度越大?。?，孔徑越小大），可分離分子量較小大的顆粒?？煞蛛x分子量較小大的顆粒。 Acr與與Bis的重量比應在的重量比應在30左右。左右。 凝膠濃度和交聯度與孔徑大小的關系凝膠濃度和交聯度與孔徑大小的關系樣品樣品分子量（分子量（DaDa

9、）適宜的凝膠濃度（）適宜的凝膠濃度（）蛋白質蛋白質105510105 52020303015152020101015155 510102 25 5聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表2. 2. 分離效應分離效應 PAGEPAGE根據其有無濃縮效應，分為：根據其有無濃縮效應，分為：連續電泳連續電泳 采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統系統不連續電泳不連續電泳 采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系系 電荷效應電荷效應不連續不連續PAGE PAGE 分子篩效應分子篩效應 濃縮效應濃縮效應 連續連續PAGEPAGE 電荷效應電荷效應:分

10、離膠中，蛋白質表面凈電分離膠中，蛋白質表面凈電荷不同，遷移率不同。荷不同，遷移率不同。 分子篩效應：大小和形狀不同的樣品分分子篩效應：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程子通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同而表現出不同的遷移率。度不同而表現出不同的遷移率。 濃縮效應：使樣品在濃縮膠中被濃縮成濃縮效應：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進入分離膠進行分離。一條窄帶，然后再進入分離膠進行分離。不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳系統的不連續性表現在以下幾個方面：系統的不連續性表現在以下幾個方面： 1.1.凝膠分上、下兩層，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為凝

11、膠分上、下兩層，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。小孔徑的分離膠。 2.2.緩沖液離子組成及各層凝膠的緩沖液離子組成及各層凝膠的pHpH不同。電極緩沖液為不同。電極緩沖液為pH8.3pH8.3的的Tris-Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.8pH6.8的的Tris-HClTris-HCl緩緩沖液，分離膠為沖液，分離膠為pH8.8pH8.8的的Tris-HClTris-HCl緩沖液。緩沖液。 3.3.在電場中形成不連續的電位梯度。在電場中形成不連續的電位梯度。 不連續系統，有三種物理效應，即樣品的濃縮效應，不連續系統，有三種物理效應，即樣品的濃縮效應，凝膠的

12、分子篩效應和電荷效應，提高了分辨率。凝膠的分子篩效應和電荷效應，提高了分辨率。三、三、SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳膠電泳sodium dodecyl sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGEelectrophoresis, SDS- PAGE簡簡稱稱SDSSDSPAGEPAGE。 是目前測定蛋白質亞基相對分子是目前測定蛋白質亞基相對分子量的一種最好的辦法量的一

13、種最好的辦法 。1.1.原理：原理：SDSSDS是種陰離子去污劑，帶有大是種陰離子去污劑，帶有大量負電荷，與蛋白質結合后使蛋白質所量負電荷，與蛋白質結合后使蛋白質所帶負電荷大大超過了天然蛋白質原有的帶負電荷大大超過了天然蛋白質原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質間原有電荷的差異。白質間原有電荷的差異。 SDSSDS破壞蛋白質氫鍵、疏水鍵，巰基破壞蛋白質氫鍵、疏水鍵，巰基乙醇使二硫鍵打開，引起蛋白質構象改乙醇使二硫鍵打開，引起蛋白質構象改變，使蛋白質變，使蛋白質SDSSDS復合物形狀近似橢圓復合物形狀近似橢圓形，短軸相同形，短軸相同1.8nm1.8nm）

14、，長軸與蛋白質），長軸與蛋白質分子量成正比。分子量成正比。 因此，蛋白質因此，蛋白質SDSSDS復合物在凝膠中復合物在凝膠中的遷移率不受蛋白質原有電荷和形狀的的遷移率不受蛋白質原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度蛋白質分子量影響，只與橢圓棒長度蛋白質分子量有關。有關。2. 2. 操作：（操作：（SDS-PAGESDS-PAGE及及PAGEPAGE，即變性及，即變性及非變性）非變性） 1 1制膠制膠: : （變性：（變性：buffer buffer 中加中加0.4%SDS0.4%SDS） a.a.分離膠：根據待分離樣品的分子大分離膠：根據待分離樣品的分子大小選擇一定濃度的分離膠查表），小選擇一定

15、濃度的分離膠查表），配制分離膠溶液：配制分離膠溶液： Acr:Bis=29:1Acr:Bis=29:1，分離膠，分離膠buffer, buffer, TEMED, AP, TEMED, AP, 水水 迅速倒膠，加水使液面平坦，室溫迅速倒膠，加水使液面平坦，室溫0.5h0.5h聚合完全。聚合完全。 b.b.濃縮膠：用濃縮膠濃縮膠：用濃縮膠bufferbuffer。插上梳。插上梳子。子。2 2樣品制備：樣品制備： a.PAGE: a.PAGE: 樣品樣品緩沖液蔗糖或甘油指樣品樣品緩沖液蔗糖或甘油指示劑溴酚藍）示劑溴酚藍） b.SDS-PAGE: b.SDS-PAGE: 樣品樣品緩沖液樣品樣品緩沖液

16、SDSSDS，甘油，甘油，巰基乙醇，溴酚藍），煮沸巰基乙醇，溴酚藍），煮沸2-5min2-5min， 以除去亞穩以除去亞穩態聚合。態聚合。3 3加樣及電泳：加樣及電泳： SDS-PAGE: SDS-PAGE: 電極電極bufferbuffer中加中加0.1%SDS0.1%SDS，溴酚藍，溴酚藍距下端距下端1cm1cm時停止電泳。時停止電泳。4 4固定及染色固定及染色a.a.固定：將凝膠浸于固定：將凝膠浸于7 7乙酸或乙酸或12.512.5三氯乙酸中三氯乙酸中固定蛋白質組分。固定蛋白質組分。b.b.染色：染色： 考馬斯亮藍染色法考馬斯亮藍染色法 銀染法靈敏度比前者高銀染法靈敏度比前者高10010

17、0倍）倍） 其它的染色方法：氨基黑、阿爾辛藍，過碘酸其它的染色方法：氨基黑、阿爾辛藍，過碘酸SchiffSchiff試劑糖蛋白）。試劑糖蛋白）。四、等電聚焦電泳四、等電聚焦電泳 ( isoelectric focusing，IEF ) 利用蛋白質具有不同等電點的利用蛋白質具有不同等電點的特性，以聚丙烯酰胺為電泳支持物，特性，以聚丙烯酰胺為電泳支持物，在其中加入載體兩性電解質商品在其中加入載體兩性電解質商品名：名：Ampholine，一種含有各種連續，一種含有各種連續 pI 的小分子混合物的電泳方法稱的小分子混合物的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳聚丙烯酰胺等電聚焦電泳IEF-PAGE）。）。自

18、學自學第五節第五節 酶的濃縮、干燥與結晶酶的濃縮、干燥與結晶一、酶的濃縮一、酶的濃縮 1 1 蒸發濃縮蒸發濃縮 圖圖 4-60 4-60 減壓蒸發濃縮的簡易裝置減壓蒸發濃縮的簡易裝置 1 1蒸餾瓶蒸餾瓶 2 2毛細管毛細管 3 3螺旋夾螺旋夾 4 4橡皮管橡皮管 5 5溫度計溫度計 6 6出水口出水口 7 7冷凝器冷凝器 8 8進水口進水口 9 9連接管連接管 1010抽氣口抽氣口 1111接收瓶接收瓶2 2 超濾濃縮超濾濃縮 超濾濃縮以壓力超濾濃縮以壓力差為動力，將待濃差為動力，將待濃縮溶液通過超濾膜，縮溶液通過超濾膜，酶分子較大被滯留，酶分子較大被滯留，水分子和小分子選水分子和小分子選擇性

19、透過，達到濃擇性透過，達到濃縮目的縮目的 。圖圖4-61 酶的超濾濃縮酶的超濾濃縮 3 3 吸水劑吸水劑 膠過濾濃縮膠過濾濃縮 利用葡聚糖凝膠利用葡聚糖凝膠Sephadex G-25Sephadex G-25或或G-50G-50等的吸水特性。將干膠直接加入等的吸水特性。將干膠直接加入樣品溶液，吸水膨潤后，再過濾或離樣品溶液，吸水膨潤后，再過濾或離心分出濃縮的酶液。心分出濃縮的酶液。聚乙二醇濃縮：聚乙二醇濃縮： 聚乙二醇聚乙二醇polyethylene glycolpolyethylene glycol），簡稱），簡稱PEG PEG 。 利用利用PEGPEG的吸水特性。將的吸水特性。將PEGPE

20、G涂于裝有酶溶液涂于裝有酶溶液的透析袋上，置于的透析袋上，置于44下，干下，干PEGPEG粉末吸收水和鹽粉末吸收水和鹽類，酶溶液即被濃縮。類，酶溶液即被濃縮。 一般用分子量大的一般用分子量大的PEG,PEG,如如PEG 6,000PEG 6,000和和PEG PEG 20,00020,000，以防止，以防止PEGPEG進入蛋白質溶液。進入蛋白質溶液。4 4 反復凍融濃縮反復凍融濃縮 利用酶溶液相對于純水冰點較低利用酶溶液相對于純水冰點較低的原理使酶分子與小分子物質分離。的原理使酶分子與小分子物質分離。 5 5 沉淀法沉淀法 鹽析法，有機溶劑法鹽析法，有機溶劑法二、酶的干燥二、酶的干燥 酶的干燥

21、多采用冷凍干燥法。酶的干燥多采用冷凍干燥法。 將酶溶液在較低溫度下（將酶溶液在較低溫度下（-10-10到到-50-50）凍結成固態，然后在高度真空）凍結成固態，然后在高度真空條件下，將其中固態水分直接升華為條件下，將其中固態水分直接升華為氣態而除去，也稱酶的升華干燥。氣態而除去，也稱酶的升華干燥。三、酶的結晶三、酶的結晶 結晶結晶CrystallizationCrystallization是指物質以晶體的狀態從蒸汽或溶液是指物質以晶體的狀態從蒸汽或溶液中析出的過程。中析出的過程。 結晶的條件結晶的條件 酶的純度酶的純度: :純度越高越易結晶（純度越高越易結晶（ 50 50 ） 2.2.酶的濃度

22、酶的濃度 （恰到好處）（恰到好處）: : 濃度越高越易結晶，控制在飽和區以濃度越高越易結晶，控制在飽和區以上，過飽和區以下的介穩區內。上，過飽和區以下的介穩區內。3. 3. 結晶溫度結晶溫度 4. 4. 溶液溶液pHpH5. 5. 離子強度離子強度 6. 6. 晶核晶核 7. 7. 結晶時間結晶時間 第五節第五節 純化方案的設計與評價純化方案的設計與評價 一、純化方案的設計一、純化方案的設計 1 純化方法的選擇依據純化方法的選擇依據 根據有效成分和雜質之間理化性質的差異根據有效成分和雜質之間理化性質的差異 調節溶解度：沉淀法調節溶解度：沉淀法 根據分子大小、形狀的不同：根據分子大小、形狀的不同

23、： 離心分離，膜分離，凝膠過濾離心分離，膜分離，凝膠過濾 根據分子電荷性質的不同：離子交根據分子電荷性質的不同：離子交換層析，電泳換層析，電泳 根據專一性結合的方法：親和層析根據專一性結合的方法：親和層析 其它：吸附層析，疏水層析其它：吸附層析，疏水層析2 2 純化方法的排序純化方法的排序 先選用粗放、快速、有利于縮小樣先選用粗放、快速、有利于縮小樣品體積的方法。準確、費時、需樣品少品體積的方法。準確、費時、需樣品少的方法，宜后選用。的方法，宜后選用。 二、純化方案的評價二、純化方案的評價1 1 酶活力測定：酶活力測定： 酶活力酶活力(enzyme activity)(enzyme activ

24、ity)又稱酶又稱酶活性，即單位時間內酶促反應的產物活性，即單位時間內酶促反應的產物生成量生成量. . 是酶催化某一化學反應的能力。是酶催化某一化學反應的能力。 方法：方法： 在酶反應開始后不同時間，從反在酶反應開始后不同時間，從反應系統中取出一定量反應液，用應系統中取出一定量反應液，用適當方法停止其反應后，再根據適當方法停止其反應后，再根據產物和底物在物化性質上的差別產物和底物在物化性質上的差別進行分析，求得單位時間的酶促進行分析，求得單位時間的酶促反應變化量。反應變化量。 常用的方法常用的方法 ： 化學分析法比色法）：產物可與化學分析法比色法）：產物可與特定的化學試劑反應生成穩定的有色溶特

25、定的化學試劑反應生成穩定的有色溶液液 。 分光光度法分光光度法: :利用底物和產物光吸收利用底物和產物光吸收性質的不同性質的不同 。 量氣法量氣法: :酶促反應中產物或底物之一酶促反應中產物或底物之一為氣體。為氣體。 滴定法滴定法pHpH值測量法）：產物之一值測量法）：產物之一是自由的酸性物質或堿性物質。多用是自由的酸性物質或堿性物質。多用pHpH電電極測。極測。 常用終止反應方法：常用終止反應方法： 改變反應最適條件：改變反應最適條件： 加酸、堿、加熱加酸、堿、加熱 加酶變性劑：加酶變性劑： 5三氯乙酸三氯乙酸 酶活力單位：通常采用國際酶學委員會規定的酶活力單位：通常采用國際酶學委員會規定的單位。單位。 在純化過程中，為了方便，可采用自行規定的在純化過程中，為了方便，可采用自行規定的單位，只要達到可比較的目的即可，如直接以光密單位，只要達到可比較的目的即可，如直接以光密度值表示。度值表示。 2 2 蛋白質濃度測定蛋白質濃度測定 紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸殘基中苯紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸殘基中苯環有共軛雙鍵，在環有共軛雙鍵，在A280A280有最大吸收。特