1、實驗九水中總大腸菌群的測定多管發酵法一實驗目的和要求1掌握多管發酵法測定水中大腸菌群的技術。2預習第六章細菌學檢驗法的關內容。二原理總大腸菌群可用多管發酵法或濾膜法檢驗。 多管發酵法的原理是根據大腸菌群能發酵乳糖、產酸、產氣，以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關特性，通過三個步驟進行檢驗求得水樣中的總大腸菌群數。 試驗結果以最可能數（ most probable number），簡稱 MPN 表示。三儀器(1)高壓蒸氣滅菌器。(2)恒溫培養箱、冰箱。(3)生物顯微鏡、載玻片。(4)酒精燈、鎳鉻絲接種棒。(5)培養皿（直徑 100mm）、試管（ 5×150mm），吸管（ 1、5

2、、10mL ）、燒杯（ 200、500、2000mL）、錐形瓶（ 500、1000mL）、采樣瓶。四培養基及染色劑的制備1乳糖蛋白胨培養液：將 10g 蛋白胨、 3g 牛肉膏、 5g 乳糖和 5g 氯化鈉加熱溶解于 1000mL 蒸餾水中，調節溶液 pH 為 7.27.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充分混勻，分裝于試管中，于 121高壓滅菌器中滅菌 15min，貯存于冷暗處備用。2三倍濃縮乳糖蛋白胨培養液： 按上述乳糖蛋白胨培養液的制備方法配制。除蒸餾水外，各組份用量增加至三倍。3品紅亞硫酸鈉培養基：貯備培養基的制備：于 2000mL 燒杯中，先將 20 30g 瓊脂加到 90

3、0mL 蒸餾水中，加熱溶解，然后加入 3.5g 磷酸氫二鉀及 10g 蛋白胨，混勻，使其溶解，再用蒸餾水補充到 1000mL，調節溶液 pH 為 7.27.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入 10g 乳糖，混勻，定量分裝于 250mL 或 500mL 錐形瓶內，置于高壓滅菌器中，在 121滅菌 15min，貯存于冷暗處備用。平皿培養基的制備： 將上法制備的貯備培養基加熱融化。根據錐形瓶內培養基的容量，用滅菌吸管按比例吸取一定量的5%堿性品紅乙醇溶液，置于滅菌試管中；再按比例稱取無水亞硫酸鈉，置于另一滅菌試管內， 加滅菌水少許使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（滅菌）。用滅菌吸管吸取已滅菌的

4、亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液內至深紅色再褪至淡紅色為止（不宜加多）。將此混合液全部加入已融化的貯備培養基內，并充分混勻（防止產生氣泡）。立即將此培養基適量（約15mL ）傾入已滅菌的平皿內，待冷卻凝固后，置于冰箱內備用，但保存時間不宜超過兩周。 如培養基已由淡紅色變成深紅色， 則不能再用。4伊紅美培養基：貯備培養基的制備：于 2000mL 燒杯中，先將 20 30g 瓊脂加到 900mL 蒸餾水中，加熱溶解。再家人 2.0g 鄰酸二氫鉀及 10g 蛋白胨，混合使之溶解，用蒸餾水補充至 1000mL，調節溶液 pH 值為 7.2 7.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入 10g 乳糖，混勻

5、后定量分裝于 250mL 或 500mL 錐形瓶內，于 121 高壓滅菌 15min，貯于冷暗處備用。第1頁共4頁平皿培養基的制備： 將上述制備的貯備培養基融化。根據錐形瓶內培養基的容量，用滅菌吸管按比例分別吸取一定量已滅菌的 2%伊紅水溶液（ 0.4g 伊紅溶于 20mL水中）和一定量已滅菌的 0.5%美藍水溶液（ 0.065g 美藍溶于 13mL水中），加入已融化的貯備培養基內，并充分混勻（防止產生氣泡） ，立即將此培養基適量傾入已滅菌的空平皿內，待冷卻凝固后，置于冰箱內備用。5革蘭氏染色劑：結晶紫染色液：將 20mL 結晶紫乙醇飽和溶液（稱取 48g 結晶紫溶于100mL95%乙醇中）和

6、 80mL 1%草酸銨溶液混合、過濾。該溶液放置過久會產生沉淀，不能再用。助染劑：將 1g 碘與 2g 碘化鉀混合后，加入少許蒸餾水，充分振蕩，待完全溶解后，用蒸餾水補充至 300mL。此溶液兩周內有效。當溶液由棕黃色變為淡黃色時應棄去。為易于貯備，可將上述碘與碘化鉀溶于 30mL蒸餾水中，臨用前再加水稀釋。脫色劑： 95%乙醇。復染劑：將 0.25g 沙黃加到 10mL95%乙醇中，待完全溶解后，加 90mL蒸餾水。五測定步驟1生活飲用水：初發酵試驗：在兩個裝有已滅菌的 50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養液的大試管或燒瓶中（內有倒管） ，以無菌操作各加入已充分混勻的水樣 100mL。在 10 支

7、裝有已滅菌的 5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養液的試管中（內有倒管） ，以無菌操作加入充分混勻的水樣 10mL混勻后置于 37恒溫箱內培養 24h。平板分離： 上述各發酵管經培養24h 后，將產酸、產氣及只產酸的發酵管分別接種于伊紅美藍培養基或品紅亞硫酸鈉培養基上，置于37恒溫箱內培養24h，挑選符合下列特征的菌落：a伊紅美藍培養基上：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色，中心色較深的菌落。b品紅亞硫酸鈉培養基上：紫紅色，具有金屬光澤的菌落；深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紅色，中心色較深的菌落。取上述特征的群落進行革蘭氏染色：a用以培養 1824h 的培養

8、物涂片，涂層要薄；b將涂片在火焰上加溫固定， 待冷卻后滴加結晶紫溶液， 1min 后用水洗去；c滴加助色劑， 1min 后用水洗去；d滴加脫色劑， 搖動玻片， 直止無紫色脫落為止 （約 2030s），用水洗去；e滴加復染劑， 1min 后用水洗去， 晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為陰性菌。復發酵試驗： 上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養液的試管中（內有倒管），每管可接種分離自同一初發酵管（瓶）的最典型菌落1 3 個，然后置于 37恒溫箱中培養24h，有產酸、產氣者（不論倒管內氣體多少皆作為產氣論），即證實有大腸菌群

9、存在。根據證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數查附表1“大腸菌群檢數表”，報告每升水樣中的大腸菌群數。2水源水于各裝有 5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養液的5 個試管中（內有倒管），分第2頁共4頁別加入 10mL水樣；于各裝有 10mL乳糖蛋白胨培養液的 5 個試管中（內有倒管），分別加入 1mL水樣；再于各裝有 10mL乳糖蛋白胨培養液的 5 個試管中（內有倒管），分別加入 1mL110 稀釋的水樣。共計 15 管，三個稀釋度。將各管充分混勻，置于 37恒溫箱內培養 24h。平板分離和復發酵試驗的檢驗步驟同“生活飲用水檢驗方法” 。根據證實總大腸菌群存在的陽性管數，查附表 2“最可能數（ MPN）

10、表”，即求得每 100mL水樣中存在的總大腸菌群數。我國目前系以1L 為報告單位，故MPN值再乘以 10，即位 1L 水樣中的總大腸菌群數。例如，某水樣接種 10mL的 5 管均為陽性；接種 1mL的 5 管中有 2 管為陽性；接種 110 的水樣 1mL的 5 管均為陰性。從最可能數（MPN）表中查檢驗結果520，得知 100mL水樣中的總大腸菌群數為49 個，故 1L 水樣中的總大腸菌群數為 49× 10=490 個。對污染嚴重的地表水和廢水，初發酵試驗的接種水樣應做 110、 1 100、 11000 或更高倍數的稀釋，檢驗步驟同“水源水”檢驗方法。如果接種的水樣量不是 10m

11、L、1mL和 0.1mL，而是較低或較高的三個濃度的水樣量，也可查表求得 MPN指數，再經下面公式換算成每 100mL的 MPN值：10(mL)MPN 值MPN 指數接種量最大的一管(mL)附表 1大腸菌群檢數表接種水樣總量300mL（ 100mL2份， 10mL10份）100mL水量的陽性瓶數10mL水量的陽性管數0121L 水樣中大腸菌群數1L 水樣中大腸菌群數1L 水樣中大腸菌群數0<3411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069>230第3頁共4頁附表 2最可能數（ MPN）

12、表（接種 5 份 10mL水樣、 5 份 1mL水樣、 5 份 0.1mL 水樣時，不同陽性及陰性情況下100mL水樣中細菌數的最可能數和95%可信限值）出現陽性份數每 100mL95%可信限出現陽性份數每 100mL水95%可信限水樣中細值樣中細菌值10mL1 mL管0.1菌數的最下限上10mL 1 mL0.1數的最可下上限管mL管可能數限管管mL 管能數限000<220171170012<0.5721071170102<0.5721192210204<0.51122092211002<0.57230123281014<0.51130081191104<0.515301112251116<0.515310112251206<0.515311144342005<0.513320144343211754652049171303301754652170231704001333152294282204011754653079251904101754653111031250411217635321403731041226978533180445004202276754013035300421269785411