1、基于靶標(biāo) IDO1、TDO 的抑制劑研究進(jìn)展 董俊敏, 劉站柱* (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所, 天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100050) 摘要：吲哚胺 2,3-雙加氧酶 1 (IDO1) 和色氨酸 2,3-雙加氧酶 (TDO) 催化色氨酸代謝的第一步也是限速步驟，與腫瘤免疫耐受和患者的不良預(yù)后相關(guān)，已經(jīng)成為腫瘤免疫治療的重要靶標(biāo)。到目前為止，有 9 個(gè) IDO1 抑制劑、3 個(gè) IDO1 / TDO雙靶點(diǎn)抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)。本篇綜述從藥物化學(xué)角度總結(jié)了IDO1抑制劑、TDO抑制劑、IDO1 / TDO 雙重抑制劑的研究進(jìn)展。 關(guān)鍵詞：吲哚胺 2,3-雙加氧酶

2、 1；色氨酸 2,3-雙加氧酶；免疫治療；抑制劑；構(gòu)效關(guān)系 色氨酸是蛋白質(zhì)合成所必須的氨基酸，對(duì)維持細(xì)胞的功能至關(guān)重要。體內(nèi)超過 95%的色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝為犬尿氨酸、犬尿酸、喹啉酸和輔酶NAD+等 。該途徑的第一步也是限速步驟，由吲哚胺 2,3-雙加氧酶 1 (IDO1)、吲哚胺 2,3-雙加氧酶 1 (IDO2) 和色氨酸 2,3-雙加氧酶 (TDO) 催化。三者都是包含血紅素的酶，具有不同的結(jié)構(gòu)、組織分布和生物學(xué)功能。IDO1 是單體酶，廣泛分布在哺乳動(dòng)物的組織、器官和細(xì)胞中；可被炎性刺激 (如干擾素-) 誘導(dǎo)；催化 L-色氨酸、D-色氨酸和各種吲哚胺類衍生物的轉(zhuǎn)化；與色氨酸的

3、非飲食分解代謝和免疫防御相關(guān)。IDO2 與 IDO1 有 43%的序列同源性，主要分布在腎小管、肝臟和精子中，色氨酸降解活性低，作用機(jī)制仍不太明確。而 TDO 是一個(gè)四聚體結(jié)構(gòu)，主要分布在哺乳動(dòng)物的肝臟中，受刺激后，也可以在胎盤、睪丸和大腦等其他組織中檢測(cè)到；TDO 具有高度的選擇性，優(yōu)先與 L-色氨酸結(jié)合；可被色氨酸、糖皮質(zhì)激素和犬尿氨酸誘導(dǎo)；負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)全身的色氨酸水平，并在癌癥免疫學(xué)中起到類似的作用。色氨酸的耗竭和犬尿氨酸等代謝物的產(chǎn)生導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生免疫抑制作用，促進(jìn)癌細(xì)胞的免疫逃逸。研究表明 IDO1 和 TDO 在多種癌癥細(xì)胞如乳腺癌、宮頸癌、腦癌等上調(diào)表達(dá)，與腫瘤的侵襲性和患者的不

4、良預(yù)后相關(guān)，其抑制劑已成為癌癥免疫治療的新策略。本文回顧了 IDO1 和 TDO 介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸的機(jī)制和各自獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，從藥物化學(xué)角度總結(jié) IDO1 抑制劑、TDO 抑制劑和 IDO1 / TDO 雙重抑制劑的研究進(jìn)展。1 IDO1 和 TDO 介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸的機(jī)制IDO1 和 TDO 催化色氨酸分解代謝，可以維持機(jī)體正常的免疫反應(yīng)幅度和持續(xù)時(shí)間, 防止健康細(xì)胞產(chǎn)生不受抑制的免疫激活。但在噁性腫瘤中 IDO1 和 TDO 的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致色氨酸耗竭和下游產(chǎn)物的積累，創(chuàng)造了一個(gè)免疫抑制微環(huán)境，使腫瘤細(xì)胞逃避有效的免疫應(yīng)答。主要包括以下 3 條路徑 (圖 1) ：色氨酸的耗竭活化 GCN-

5、2 激酶，導(dǎo)致其下游靶標(biāo) e IF-2 磷酸化和衰減，導(dǎo)致效應(yīng) T細(xì)胞 (Teff) 在 G1 周期增殖停滯。 色氨酸的耗竭抑制 m TOR 所介導(dǎo)的分子應(yīng)激反應(yīng)，誘發(fā) Teff 細(xì)胞自噬。色氨酸的分解代謝物犬尿氨酸與內(nèi)源性芳烴受體 (AhR) 的結(jié)合，導(dǎo)致 Treg 細(xì)胞選擇性分化增殖；同時(shí)阻止輔助性 T 細(xì)胞17 (Th17) 的成熟，進(jìn)而抑制 DC 細(xì)胞的浸潤(rùn)和細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)。值得注意的是，IDO1 涉及到這三種效應(yīng)途徑，而 TDO 的免疫作用主要?dú)w功于活化 GCN-2 通路和與 AhR 的結(jié)合。除了色氨酸和犬尿氨酸誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答外，喹啉酸、3-羥基犬尿氨酸等代謝物的產(chǎn)生還

6、會(huì)影響巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，抑制 NK 細(xì)胞的增殖和功能，這些路徑共同介導(dǎo)局部和/或全身性的免疫抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移。2 IDO1 和 TDO 的結(jié)構(gòu) IDO1是包含血紅素鐵的單體氧化酶，分子質(zhì)量約為45 kDa，可以分成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域 (圖2A)，大的結(jié)構(gòu)域 (口袋A) 是由13個(gè)-螺旋 (G-S) 和2個(gè)310螺旋組成；4個(gè)長(zhǎng)螺旋 (G、I、Q、S) 與其他3個(gè)短螺旋 (K、L、N) 共同構(gòu)成血紅素結(jié)合口袋；小的結(jié)構(gòu)域 (口袋B) 由6個(gè)-螺旋 (A-F)、兩個(gè)短-折疊和3個(gè)310螺旋構(gòu)成。 TDO 是由分子質(zhì)量在 3545 kDa 的單體組成的同型四聚體酶，從細(xì)菌到人類結(jié)構(gòu)都非常保守

7、。hTDO 單體由 15 個(gè) 螺旋組成，可以被分成 3 個(gè)主要的區(qū)域 (圖 2B)N 端區(qū)域 (a1a3)、大結(jié)構(gòu)域 (a4a9、a13、a14) 和小結(jié)構(gòu)域 (a10a12、a15)。4 個(gè)單體 (AD，圖 2C) 通過 3 個(gè)相互垂直的雙向軸關(guān)聯(lián)，相連兩個(gè)單體的相互作用力更強(qiáng)，其中兩個(gè) C 形二聚體 (AB 和 CD) 彼此垂直地被夾緊而形成緊密的四聚體。 hTDO 和 hIDO 總體氨基酸序列同源性雖然只有 10，但它們的大結(jié)構(gòu)域顯示相似的折疊，可以共享相對(duì)保守的活性位點(diǎn)區(qū)域，小結(jié)構(gòu)域的整體結(jié)構(gòu)和空間方向有所不同 )。總之，這些結(jié)構(gòu)可以幫助人們更深入的了解酶與底物結(jié)合、催化的分子機(jī)制，也

8、為設(shè)計(jì)新型的 IDO1 和 TDO 抑制劑提供了幫助。3 臨床進(jìn)展 3.1 進(jìn)入臨床研究的 IDO1 抑制劑 對(duì) IDO1 選擇性抑制劑的研究已引起醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注，相關(guān)專利文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了數(shù)千種化合物，但還沒有抑制劑上市。表 1 為處于臨床研究階段的 9 個(gè)小分子化合物，其中已知的結(jié)構(gòu)式如圖 3，這些化合物除了作為單體使用，還可以和化學(xué)療法、免疫檢查點(diǎn)療法、放射療法等聯(lián)合使用，相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)聯(lián)合用藥的臨床進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)的綜述。3.2 進(jìn)入臨床研究的 IDO1 / TDO 雙重抑制劑 TDO 和 IDO1 在某些腫瘤的表達(dá)是重疊的，因此探索 TDO 抑制劑、IDO1 / TDO 雙重抑制劑具有合理性

9、。目前尚未有選擇性 TDO 抑制劑進(jìn)入臨床研究，有3 個(gè) IDO1 / TDO 雙重抑制劑已進(jìn)入臨床研究階段 (表 2)，均由中國(guó)制藥公司研發(fā)，但具體的結(jié)構(gòu)并未公開。 4 新型抑制劑研究進(jìn)展 4.1 IDO1 抑制劑 2003 年，Van den Eynde 首次證明 IDO1 與癌癥相關(guān)，在學(xué)術(shù)界和制藥公司興起一股熱潮來(lái)尋找新穎的抑制劑骨架。已有研究者對(duì) IDO1 抑制劑進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，下文將根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)類型對(duì)最新研究結(jié)果進(jìn)行綜述。 4.1.1 咪唑結(jié)構(gòu) NewLink 基因公司從 4-苯基咪唑 (7，圖 4，IC50 = 48 mol·L-1) 出發(fā)得到的化合物 NLG-9

10、19 (5，IC50 = 28 nmol·L-1) ，目前已經(jīng)進(jìn)入到臨床期研究階段，用于實(shí)體瘤的治療。咪唑并5, 1-a異吲哚母核增加了分子的剛性，改善了生化和細(xì)胞效能。分子對(duì)接顯示 NLG-919 母核的 2-位氮原子直接與血紅素的鐵原子配位，三環(huán)骨架通過范德華力與口袋 A 上的殘基 Val130、Phe163、Phe164 和 Leu234 緊密連接，11-位羥基可以與丙酸血紅素形成氫鍵，環(huán)己醇部分則伸向口袋 B，末端羥基參與形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)，這些相互作用有助于生物活性的提高。對(duì) NLG-919 衍生物 8 (IC50 = 38 nmol·L-1) 的研究進(jìn)一步闡明了廣泛的

11、疏水相互作用和獨(dú)特的氫鍵網(wǎng)絡(luò)有利于提高咪唑異吲哚衍生物的抑制活性。2019 年，Tu 等報(bào)道了對(duì) NLG-919 側(cè)鏈的改造：用不同環(huán)狀基團(tuán)取代側(cè)鏈，活性均下降或失活，只有苯基哌啶基取代維持相似的活性。合成并評(píng)估了一系列取代的哌啶基，手性分離得到對(duì)映體 9 (IC50 = 9.7 nmol·L-1) 活性最好。9 沒有羥基不能形成氫鍵，但側(cè)鏈可以更深地插入口袋 B 中，甲基吡唑環(huán)與殘基 Arg231 之間存在的陽(yáng)離子- 相互作用使其成為更有效的抑制劑。綜上，苯基咪唑骨架是研究 IDO1抑制劑的良好起點(diǎn)，咪唑并5,1-a異吲哚作為一類新的藥效團(tuán)結(jié)構(gòu)，仍具有廣闊的研究空間。2020 年，

12、Serafini 等基于 IDO1 結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)了苯并咪唑類化合物 10 (圖 5，IC50 =16 nmol·L-1)，對(duì) 10 進(jìn)行系列的結(jié)構(gòu)修飾，構(gòu)效關(guān)系總結(jié)如下：苯并咪唑 1-位 N 與血紅素鐵離子直接作用，被移除活性消失；5-位被 Br 原子取代，增加與口袋 A 的親和力，保持活性；仲酰胺的 NH 參與 IDO1 活性位點(diǎn)內(nèi)關(guān)鍵氫鍵的形成，被取代活性下降；右側(cè)為吡咯環(huán)時(shí)活性最好，吡咯環(huán)上的 NH 可以和血紅素形成氫鍵，溴原子可以與殘基形成鹵素鍵，被取代或移除活性均下降。所選化合物 (1013) 在幾種腫瘤細(xì)胞中顯示納摩爾水平的抑制作用，沒有明顯的細(xì)胞毒性。化合物 1

13、2 的體外代謝穩(wěn)定性要優(yōu)于 11、13，在體外相同時(shí)間內(nèi)，分別殘留 65%、32%、59%的底物；靜脈注射 12 后，小鼠血漿中犬尿氨酸水平在 2 min 內(nèi)迅速下降，并在 30 min 內(nèi)保持在基礎(chǔ)水平以下，證明 12 在體內(nèi)也是有效的。但體內(nèi)半衰期 (t1/2 = 0.65 h) 很短，需要優(yōu)化藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。總之 12與已知的 IDO1 抑制劑相比，在化學(xué)結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)的構(gòu)成、合成的可行性上展現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。基于 IDO1 / Amg-1 的晶體結(jié)構(gòu)，Tojo 等對(duì) Amg-1 (14，圖 6) 進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到咪唑并噻吩類化合物，其中化合物 15 (IC50 = 77 nmol

14、3;L-1) 活性最高。2018年 Griglio 等和 2019 年 Serafini 等保持 15 的咪唑并噻唑骨架和對(duì)溴苯基部分不變，對(duì)側(cè)鏈進(jìn)行了修飾和生物學(xué)評(píng)估。咪唑氮與血紅素鐵配位，對(duì)溴苯基插入口袋 A 中，與周圍殘基發(fā)生疏水相互作用，側(cè)鏈則插入口袋 B 中。化合物 1619 IDO1 酶學(xué)抑制活性最高，IC50在 0.20.8 mol·L-1之間，但仍較 15 要弱。遺憾的是，這一類化合物對(duì)細(xì)胞膜的滲透性低，在體外 A375 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中沒有顯示IDO1 的抑制性。4.1.2 N-羥基脒結(jié)構(gòu) Incyte 公司的臨床候選化合物 pacadostat (2, IC50 = 7

15、3nmol·L-1) ，目前正在進(jìn)行期臨床試驗(yàn)，用于多種癌癥的治療。但數(shù)據(jù)顯示epacadostat 在體內(nèi)被代謝酶UGT1A9 轉(zhuǎn)化為 O-葡萄糖醛酸共軛化合物 20 (圖 7)，半衰期只有 2.5 h，疏水性比較差 (CLog P = 0.09)，口服生物利用度不盡滿意 (大鼠和靈猴口服生物利用度分別是 11%、33%)。因此，有必要對(duì) epacadostat 進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，發(fā)現(xiàn)藥效和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)更佳的化合物。 Meng 課題組在 4 位側(cè)鏈引入一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)以增加分子的空間位阻，使其完全占據(jù)口袋 B，通過調(diào)節(jié)環(huán)狀同源物的電子和空間效應(yīng)來(lái)研究構(gòu)效關(guān)系。但改造的效果不是很理想，只有少部

16、分化合物保持納摩爾活性。化合物 21、22通過環(huán)化末端氨磺酰胺部分得到，化合物 23、24是在磺酰胺基團(tuán)和噁二唑環(huán)之間引入環(huán)狀結(jié)構(gòu)，它們?cè)?HEK293 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中保持與 epacadosta 相似的活性，IC50在 16.868.59 nmol·L-1之間。值得注意的是，化合物 23 與 epacadosta 相比，藥動(dòng)學(xué)性能顯著提高，半衰期延長(zhǎng)至 3.82 h，大鼠口服生物利用度達(dá) 33.6%。同時(shí)在 CT-26 同系異種移植模型中，口服化合物 23 與 epacadostat 具有相似的治療效果，適合作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步開發(fā)。 2020 年，Steeneck 等將 epacad

17、ostat 側(cè)鏈的 NH 用 S 原子取代，得到 S-EPA (25, IC50 = 130 nmol·L-1)，細(xì)胞活性較 epacadosta 提高了 3 倍。對(duì) S-EPA 進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，發(fā)現(xiàn)口袋 A 處苯環(huán)上取代基的極性變化對(duì)活性有顯著的影響；側(cè)鏈末端具有磺酰胺基可以提高效能和代謝穩(wěn)定性。優(yōu)選的化合物 26 (IC50 = 21 nmol·L-1) 在人源化肝小鼠模型中，葡萄糖醛酸化代謝作用明顯降低。Du 等用磷酰胺基團(tuán)代替epacadostat 的磺酰胺基團(tuán)得到一系列含磷酸氨基酯的化合物，其中化合物 27 (IC50 = 104 nmol·L-1，HeL

18、a IC50 = 10.1 nmol·L-1) 展示了良好的IDO1 抑制活性，與 epacadostat 對(duì) Lewis 細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)有同等的抑制活性 (77%的抑制率)，但半衰期短、口服生物利用度也未提高。 其他 N-羥基脒類化合物還有 28、29，用苯并噁二唑環(huán)代替苯環(huán)，生物活性保持在納摩爾水平, IC50分別為 80、59 nmol·L-1。總之，N-羥基脒是這類化合物強(qiáng)抑制活性的關(guān)鍵藥效團(tuán)。在對(duì) epacadostat 的結(jié)構(gòu)修飾方面，重點(diǎn)是在保持細(xì)胞活性的同時(shí)降低體內(nèi)葡萄糖醛酸化代謝速率來(lái)改善藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。4.1.3 聯(lián)苯羧酸類 近年來(lái)，Jure-Kunk

19、el 課題組通過高通量篩選得到聯(lián)苯羧酸類化合物 30 (圖 8，IC50 = 0.087 mol·L-1) ，通過四唑基團(tuán)等位取代羧基、取代基的優(yōu)化等，得到化合物 31 (HeLa IC50 = 4 nmol·L-1) 活性最佳。分子 32 (HeLa IC50 = 13 nmol·L-1)與 hIDO1 晶體結(jié)構(gòu)對(duì)接顯示：羧基的氧原子與血紅素鐵形成六配位，苯環(huán)占據(jù)了口袋 A，二異丁基氨基和對(duì)甲苯脲部分延伸到口袋 B 中，尿素的兩個(gè) NH 都與血紅素的丙酸基團(tuán)形成氫鍵。基于此，2020 年，Cai 等用萘環(huán)或苯并五元雜環(huán)取代化合物 32 的苯環(huán)并保留羧基，評(píng)估體內(nèi)

20、外 IDO1 的抑制活性。這類化合物構(gòu)效關(guān)系顯示：羧基和脲基是保持活性所必需的基團(tuán)；左側(cè)芳環(huán)自身的電子云密度對(duì)活性影響較大，其上有鹵素基團(tuán)可以更好地提高親脂性。萘環(huán)系列活性最好的化合物是 33 (HeLa IC50 = 2.6 nmol·L-1)，苯并五元雜環(huán)系列活性最好的是 34 (HeLa IC50 = 12.8 nmol·L-1)。化合物 33 在 MTT 實(shí)驗(yàn)中并未顯示細(xì)胞毒性，在小鼠體內(nèi)抗腫瘤研究中，作為單體使用效果與 epacadostat 相當(dāng) (抑制率為 53.9%)，與 5-氟尿嘧啶合用時(shí)，抑制率高達(dá) 92.8%，值得進(jìn)一步的研究。 4.1.4 醌類結(jié)構(gòu)

21、醌類化合物大多來(lái)源于天然產(chǎn)物及其衍生物。近年來(lái)，新的天然產(chǎn)物被報(bào)道。2015 年，Blunt 等發(fā)現(xiàn)異噻唑苯醌天然產(chǎn)物 aulosirazole (35，IC50 = 0.08 mol·L-1) 和 ronqodine A (36， IC50 = 0.13 mol·L-1) 都是有效的IDO1 抑制劑。 2019 年， Pan 等從細(xì)極鏈格孢菌 (Alternaria enuissima) DFFSCS013 中分離出 3 個(gè)新型蒽醌類化合物：anthrininone B、C (37、38) 和 39，具有明顯的 IDO1 酶抑制活性，IC50分別是 4.2、0.5、1.7

22、 mol·L-1，但在 HEK293細(xì)胞中，10 mol·L-1的濃度也沒有產(chǎn)生抑制活性。值得注意的是，天然醌結(jié)構(gòu)是細(xì)胞內(nèi) NQO1 等還原性輔因子的有效底物，歷經(jīng)細(xì)胞內(nèi)輔因子依賴的氧化還原循環(huán)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)限制醌類化合物在高濃度下使用。 2018 年，Pan 等設(shè)計(jì)合成了 60 個(gè)新型萘醌衍生物，對(duì) A、B 環(huán)進(jìn)行不同的改造，構(gòu)效關(guān)系總結(jié)如下: 2 位被 4-吡啶基或 4-咪唑基取代活性最好，吡啶基或咪唑基上有任何的取代基活性下降；在 1,4-萘醌的 C-5 或 C-8 位引入 N 原子活性下降；B 環(huán)是噻唑環(huán)比咪唑環(huán)活性要好。選擇兩個(gè)活性最高的化合物 40 (I

23、C50 = 26 nmol·L-1)、41 (IC50 = 18 nmol·L-1) 進(jìn)行深入研究。40、41 可使大鼠血漿中犬尿氨酸水平分別下降 50.1%和 30.5%，同時(shí)在其對(duì) IDO1 的有效抑制濃度下均無(wú)細(xì)胞毒性 (在 MTT 毒性實(shí)驗(yàn)中，CC50 > 20 mol·L-1)，這兩個(gè)化合物被選作先導(dǎo)化合物進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。4.1.5 吲哚結(jié)構(gòu) 在過去的幾十年中，大多數(shù)色氨酸類似物被證明可以作為 IDO1抑制劑。最經(jīng)常使用的就是 1-甲基-色氨酸 (1-MT, 42, 圖 10)，現(xiàn)在多作為化學(xué)工具研究 IDO1 的生物學(xué)作用。1-MT 和低氧細(xì)

24、胞毒素替拉扎明 (TPZ) 的雜合分子 43 (Ki = 76.3 mol·L-1) ，首先作為低氧細(xì)胞毒素起作用，然后它們的代謝產(chǎn)物 TPZ - NO 雜合物作為 IDO1 抑制劑，具有獨(dú)特的作用模式。含有 D-1-MT的 Pt (IV) 復(fù)合物 44 和 45 作為免疫化療劑，可以促進(jìn) T 細(xì)胞增殖，促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)作用。2017 年，Crosignani 等開發(fā)出琥珀酰亞胺類化合物 PF-06840003 (4，IC50 = 0.41 mol·L-1)，用于治療 IV 級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或 III 級(jí)間變性膠質(zhì)瘤，正在進(jìn)行 I 期臨床試驗(yàn)，PF-06840003 與大多數(shù) I

25、DO1 抑制劑不同，它不與血紅素鐵結(jié)合，而是通過與 hIDO1 形成高密度氫鍵發(fā)揮作用。總體來(lái)說，這一類化合物值得進(jìn)一步研究癌癥影像學(xué)、癌癥免疫化學(xué)療法等新應(yīng)用。 4.1.6 其他結(jié)構(gòu) BMS (百時(shí)美施貴寶) 公司開發(fā)的 MS-986205 (3, IC50 = 1.7 nmol·L-1)，與 PD-1 抑制劑nivolumab 聯(lián)合用藥, 處于臨床期研究階段。值得注意的是，MS-986205 是與不含亞鐵血紅素的 IDO1 蛋白結(jié)合，具有獨(dú)特的結(jié)合模式。分子對(duì)接顯示：苯環(huán)占據(jù)口袋 A，與 Tyr126 形成-相互作用；酰胺上的 NH 與 Ser167 形成氫鍵；環(huán)己烷作為連接基團(tuán)

26、將喹啉環(huán)導(dǎo)向一個(gè)新的疏水性口袋；喹啉環(huán)與 Phe270 形成-相互作用；喹啉上的氮原子與 Arg343 形成氫鍵。這種結(jié)合模式，為抑制劑的設(shè)計(jì)提供了新的思路。此外，非天然產(chǎn)物來(lái)源的化合物 (4648, 圖 11)，IC50分別是 36 nmol·L-1、0.22 mol·L-1、151 nmol·L-1，為 IDO1 抑制劑提供了多樣性的結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)。2019 年，Xu 等采用虛擬篩選的策略，結(jié)合相似性搜索和分子對(duì)接方法發(fā)現(xiàn)了氰基吡啶骨架化合物，分子對(duì)接顯示：嘧啶環(huán)中的腈基直接與鐵血紅素結(jié)合，嘧啶環(huán)位于口袋 A 中，另一個(gè)芳環(huán)占據(jù)口袋 B中

27、，其中化合物 49 (IC50 = 84 nmol·L-1) 活性最好。 4.2 TDO 抑制劑 與 IDO1 相比，TDO 雖然在 1930s 年就被發(fā)現(xiàn)，但直到 2011 年，一項(xiàng)腦腫瘤研究才正式將 TDO 與癌癥聯(lián)系起來(lái)，使該酶成為有興趣的藥理學(xué)靶標(biāo)。目前針對(duì) TDO 的類似研究仍處于初始階段，只有少量的 TDO 抑制劑被報(bào)道。下文對(duì)有代表性的結(jié)構(gòu)進(jìn)行簡(jiǎn)要概述。 4.2.1 吲哚結(jié)構(gòu) 自 TDO 發(fā)現(xiàn)以來(lái)，少數(shù)基于吲哚骨架的化合物被發(fā)現(xiàn)具有 TDO抑制活性。1995 年，Salter 等58開發(fā)了一系列 3-(2-(吡啶基)乙烯基) 吲哚類化合物作為 TDO / 5-羥色胺再攝

28、取組合抑制劑用于治療抑郁癥，其中 68OC91 (50，圖 12，IC50 = 0.28 mol·L-1)，它對(duì)肝臟提取的 TDO 具有出色的體外抑制活性 (Ki約為 30 nmol·L-1)。但溶解度低，生物利用度差，未進(jìn)行更深入的研究。2011 年，Dolusic 等將 68OC91 與 XcTDO (野油菜黃單胞菌 TDO) 進(jìn)行分子對(duì)接，顯示吲哚的 NH 基團(tuán)與殘基 His55 形成 H 鍵穩(wěn)定吲哚環(huán)，3-吡啶基向活性位點(diǎn)的入口突出，并與殘基 Thr254 的 NH 形成 H 鍵。基于此模型，Dolusic 合成了 70 多個(gè)類似物，在細(xì)胞水平測(cè)定 TDO 的抑制活

29、性。構(gòu)效關(guān)系總結(jié)如下：吲哚骨架是保持活性所必需的結(jié)構(gòu)，NH 參與形成氫鍵，不可被取代；母核 5 位或 6 位被 F 取代或沒有取代基時(shí)活性最佳；連接鏈為反雙鍵或炔鍵可以保留活性；3 位側(cè)鏈引入帶負(fù)電荷的基團(tuán)，可與殘基通過氫鍵作用增加溶解度而不影響穩(wěn)定性。盡管得到了相對(duì)完整的構(gòu)效關(guān)系，但仍無(wú)法顯著提高該系列化合物的 TDO 抑制活性。含四唑基團(tuán)的 LM10 (51，IC50 = 0.62 mol·L-1) 和含羧基的化合物 52 (IC50 = 3 mol·L-1)，活性較 50 稍弱，但具有改善的理化參數(shù)，表現(xiàn)為低親脂性 (log D7.4分別為 0.2 和 0.6)、高溶

30、解度和高穩(wěn)定性，特別是 LM10，具有高的口服生物利用度。LM10 因其高選擇性、高活性成為最具潛力的候選藥物，在臨床前實(shí)驗(yàn)中還顯示出有效的抗腫瘤活性。 2016 年 Abdel-Magid 等合成了一系列 3-吲哚衍生物，以化合物 53 (A172 IC50 = 27 nmol·L-1) 和 54 (A172 IC50 = 26 nmol·L-1) 細(xì)胞水平活性最好。但重要特性如溶解度、生物利用度和抗腫瘤活性的結(jié)果未公開。4.2.2 萘三唑二酮結(jié)構(gòu) 2015 年，Wu 等采用基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選方法得到苗頭化合物 55 (圖 13, IC50 = 711 nmol·

31、;L-1)，包含萘三唑二酮的核心結(jié)構(gòu)，具有潛在的 TDO 抑制活性。當(dāng)去掉芐基或者對(duì)萘三唑二酮結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，均使活性消失，證明核心結(jié)構(gòu)和苯基與血紅素和周圍殘基的相互作用是保持活性的重要原因，該類化合物構(gòu)效關(guān)系研究集中在對(duì)苯環(huán)的修飾，在 N-芐基的對(duì)位和間位引入剛性叔酰胺可顯著提高對(duì) TDO 的抑制作用。其中化合物 56 (IC50 = 30 nmol·L-1) 的抑制活性最高。分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，55 和 56 的萘三唑二酮和苯基結(jié)構(gòu)高度重疊，與血紅素基團(tuán)和周圍殘基具有相似的配位和疏水相互作用，但 56 的 N-甲基哌嗪酰胺基團(tuán)與殘基 Arg144 形成額外的氫鍵增強(qiáng)了 TDO 的抑制活性

32、。同時(shí)，56 對(duì) TDO抑制活性比 IDO1 抑制活性 (IC50 = 640 nmol·L-1) 高 21 倍，高選擇性的原因是56 無(wú)法與 IDO 中的殘基 Arg231 (TDO 中的相應(yīng)殘基 Arg144) 相互作用。根據(jù)上述結(jié)果，設(shè)計(jì)與 hTDO 中殘基 Arg144 相互作用的化合物將是提高 TDO 抑制劑活性和選擇性的有效方法。化合物 56 是第一個(gè)通過基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選鑒定的新型 TDO 抑制劑，需要進(jìn)一步評(píng)估其作為癌癥治療劑的潛力。2019 年，Hua 等提出將 TDO 抑制劑引入 Pt (IV) 復(fù)合物的策略。通過釋放順鉑以損傷 DNA 的方式誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，同時(shí)

33、生成 TDO 抑制劑阻斷 TDO 蛋白的表達(dá)，促進(jìn) T 細(xì)胞增殖并殺死癌細(xì)胞，提高化療藥物的治療效果。復(fù)合物58 (IC50 = 1.06 mol·L-1) 與 57 (IC50 = 5.23 mol·L-1)、順鉑 (IC50 = 3.85 mol·L-1) 相比，在 MTT 實(shí)驗(yàn)中展示了最強(qiáng)的細(xì)胞毒性。同時(shí) 58 具有適中的 TDO 酶抑制活性 (IC50 = 0.85 mol·L-1)，在 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)中可以有效下調(diào) TDO 蛋白的表達(dá)，阻斷犬尿氨酸的產(chǎn)生，促進(jìn) T 細(xì)胞增殖，顯著改善腫瘤免疫微環(huán)境。相關(guān)方法的協(xié)同作用及相關(guān)的強(qiáng)化機(jī)制有待于

34、繼續(xù)研究。4.2.3 氨基異噁唑結(jié)構(gòu) 2018 年 Pei 等通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)苗頭化合物 4-苯基-5-氨基異噁唑 59 (圖 14)，SW48 細(xì)胞 EC50為 85 nmol·L-1，從異噁唑環(huán)氨基的修飾、苯環(huán)的取代或替換、異噁唑的替換三方面對(duì) 59 進(jìn)行修飾 (圖 14)。構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn)：5-氨基異噁唑結(jié)構(gòu)是抑制 TDO 所需的核心結(jié)構(gòu)，替換活性降低；苯環(huán)的取代或替換 (化合物 6062) 對(duì)活性影響程度較小，其中以化合物 62 (SW48 EC50 = 77 nmol·L-1) 細(xì)胞活性最好。62 對(duì) TDO 的選擇性是 IDO1 的 6 倍，酶實(shí)驗(yàn)沒有觀察到對(duì)細(xì)胞

35、色素 P450 的抑制作用，并且在全血的穩(wěn)定性更高。總之，這一類化合物存在全血中穩(wěn)定性不高的問題，未來(lái)研究應(yīng)明確其不穩(wěn)定的原因以及與結(jié)構(gòu)的關(guān)系。 4.2.4 其他結(jié)構(gòu) 1961 年，氧化還原活性化合物如兒茶酚、對(duì)苯二酚、對(duì)苯醌、L-二羥基苯丙氨酸和 L-腎上腺素被發(fā)現(xiàn)作為 TDO 抑制劑。2014 年，Pantouris等篩選了將近 2 800 種化合物，采用 hTDO 酶促分析方法鑒定了 7 種有效的TDO 抑制劑，其抑制常數(shù) (Ki) 在納摩爾或低微摩爾范圍內(nèi)，但沒有報(bào)告這些TDO 抑制劑的 IC50值。其中黃酮類化合物 NSC36398 (63，圖 15) 對(duì) TDO 的 Ki約為 16

36、 mol·L-1，而對(duì) IDO1 的 Ki值超過 100 mol·L-1，是選擇性最好的化合物，可以進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。2018 年，Zhang 等評(píng)估了天然產(chǎn)物色胺酮 64 (IC50 = 3.94 mol·L-1) 和衍生物潛在的 TDO 抑制活性，其中化合物 65、66 的酶活性分別是 0.937 和 0.1 mol·L-1，相較于 IDO1 有良好的選擇性 (分別是 38 倍和 88 倍)。構(gòu)效關(guān)系表明：8 位是吸電子基團(tuán)活性要優(yōu)于給電子基團(tuán)；2 位、7位、9 位被取代不利于 TDO 抑制活性。分子對(duì)接顯示色胺酮環(huán)通過 O-Fe 配位作用和疏水

37、相互作用直接結(jié)合到 hTDO 的活性位點(diǎn)。化合物 65 和 66 具有發(fā)展成為新型 TDO 抑制劑并應(yīng)用于 TDO 相關(guān)靶標(biāo)治療的潛力。2020 年，Parr 等根據(jù)IDO1 選擇性抑制劑 NLG-919 (5，IDO1 EC50 = 0.45 mol·L-1; TDO EC50 = 2.0 mol·L-1) 的結(jié)構(gòu)，保留骨架咪唑并異吲哚，對(duì)側(cè)鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。當(dāng)側(cè)鏈為四氫苯并噁二唑 67 (IC50 = 0.054 mol·L-1)、N-稠合四氫吡唑并吡啶 68 (IC50 = 0.13 mol·L-1)、四氫苯并吡啶 69 (IC50 = 0.05 m

38、ol·L-1) 時(shí)具有較高的 TDO 選擇性和抑制活性。在肝微粒體和肝細(xì)胞中，有適中的代謝穩(wěn)定性。4.3 IDO1 / TDO 雙重抑制劑 2018 年，ECHO-301 (IDO1 抑制劑 epacadostat 與 PD-1 檢查點(diǎn)抑制劑pembrolizumab 聯(lián)合用藥) 用于治療不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的期臨床實(shí)驗(yàn)以失敗告終。實(shí)驗(yàn)失敗的原因一方面可能是藥效學(xué)指標(biāo)不適用或藥物組合策略不匹配。另一方面可能是對(duì) IDO1 在生理病理中的確切調(diào)控機(jī)制以及對(duì)腫瘤微環(huán)境等的影響了解的不夠深入，epacadostat 選擇性阻斷 IDO1 的表達(dá)，但 TDO 通路可以發(fā)揮潛在的代償作用引

39、起腫瘤免疫抑制效應(yīng)。因此開發(fā)組合或泛型 IDO1 / TDO 抑制劑，可以克服選擇性 IDO1 抑制劑在臨床試驗(yàn)中的不足，擴(kuò)大癌癥治療的適用范圍。下文對(duì)文獻(xiàn)中有代表性的結(jié)構(gòu)進(jìn)行闡述。 4.3.1 吲哚結(jié)構(gòu) 2019 年 Cui 等通過對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)隨機(jī)篩選發(fā)現(xiàn)了具有 2-羧酸吲哚骨架的新型 IDO1 / TDO 雙重抑制劑 70 (圖16，IDO IC50 = 40.7 mol·L-1；TDO IC50 = 99.2 mol·L-1) 和 71 (IDO IC50 = 35.6 mol·L-1；TDO IC50 = 22.5mol·L-1)，以其為先導(dǎo)化合物進(jìn)

40、行廣泛的結(jié)構(gòu)修飾，總結(jié)構(gòu)效關(guān)系如下 (圖 16)：2-羧基吲哚骨架和 4 位 NH 連接鏈?zhǔn)潜３只钚运匦璧慕Y(jié)構(gòu)；骨架 7 位修飾空間有限，甲基、氰基、硝基等取代時(shí)活性消失，只有 F 原子和甲氧基取代保持活性；6 位乙酰氨基或乙胺基通過氫鍵促進(jìn)與 IDO1 或 TDO 的結(jié)合，增加活性；4 位連接鏈上苯環(huán)的取代方式及取代基的性質(zhì)對(duì)活性影響較大，苯環(huán) 3位上是-F、-OCH3、-CH3等小的疏水性基團(tuán)有利于活性，苯環(huán) 4位上是氫鍵受體如 F 或 O 原子可增加與酶的親和力。化合物 72 (IDO IC50 = 8.4 mol·L-1；TDO IC50 = 8.84 mol·L

41、-1) 和IDO1 / TDO 酶的分子對(duì)接顯示 2-羧基吲哚骨架位于血紅素頂部的口袋中，結(jié)構(gòu)修飾空間非常有限；而在 4 位的芳香族基團(tuán)可以延伸到環(huán)和 IDO1 中殘基 Arg231 (TDO 中殘基 Arg144) 周圍的區(qū)域，具有一定的靈活性，可增加結(jié)構(gòu)多樣性。在A172 細(xì)胞中，化合物 73 (IDO IC50 = 3.18 mol·L-1；TDO IC50 = 7.12 mol·L-1) 是最有效的抑制劑，在濃度為 100 mol·L-1時(shí)抑制率為 77.7%，在濃度為 50 mol·L-1時(shí)抑制率為 55.9%，在 10 mol·L-

42、1時(shí)可以促進(jìn) T 細(xì)胞增殖，但活性遠(yuǎn)比 NLG-919要弱。值得注意是，Cui同時(shí)鑒定了化合物72的衍生物74 (IDO IC50 = 18 nmol·L-1；TDO IC50 = 25 nmol·L-1)，一類新型的醌衍生物，對(duì) IDO1 和 TDO 的抑制性更高，IC50 值均達(dá)到納摩爾水平。這一發(fā)現(xiàn)可以用于指導(dǎo)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以開發(fā)活性更強(qiáng)的 IDO1 / TDO 雙重抑制劑。 4.3.2 吲唑結(jié)構(gòu) Qian 課題組之前研究的吲唑類化合物 LWQ-84 (75，圖 17, IC50 = 5.3 mol·L-1) 具有弱的 IDO1 抑制活性，沒有 TDO

43、的抑制活性，在細(xì)胞 (HeLa細(xì)胞和 A172 細(xì)胞) 實(shí)驗(yàn)和CT26 異種移植模型中幾乎沒有抗癌作用。2019 年，該課題組以 LWQ-84 為先導(dǎo)化合物，通過改變 4 位氨基上的取代基，合成了 38個(gè)吲唑衍生物，但改造效果并不令人滿意，只有幾個(gè)化合物與 LWQ-84 的活性相當(dāng)或更好。其中，化合物 76 對(duì) IDO1 和 TDO 的抑制作用最強(qiáng)，IC50分別為 0.74和 2.93 mol·L-1。且在 HeLa 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中顯示 IDO1 抑制活性 (IC50 = 1.37 mol·L-1)，在 A172 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中顯示 TDO 抑制活性 (IC50 = 7.54 mo

44、l·L-1)，在 CT26異種移植模型中表現(xiàn)出體內(nèi)抗腫瘤活性。總體來(lái)說，吲唑類化合物還需要進(jìn)一步探索結(jié)構(gòu)優(yōu)化的位點(diǎn)。 4.3.3 其他母核結(jié)構(gòu) 近年，Kuang 課題組72,73對(duì)天然產(chǎn)物色胺酮的 2 位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了 24 個(gè)衍生物。大部分化合物都具有相似的 IDO1 和 TDO 抑制活性，在基于細(xì)胞的測(cè)定中均顯示出比酶活法測(cè)定更高的抑制活性，N-芐基取代的色胺醌 (77，圖 18，IDO IC50 = 0.5 mol·L-1；TDO IC50 = 0.76 mol·L-1) 活性要高于 N-苯基取代的色胺醌 (78，IDO IC50 = 2.2 mol·L-1；TDO IC50 = .59 mol·L-1)，化合物 79 對(duì) IDO1 和 TDO 抑制活性最佳，IC50分別是 0.12 和 0.0