1、1q原核生物RNA的轉錄 RNA Transcription in Prokaryotesv轉錄的基本原則轉錄的基本原則 Basic Principles of Transcription v大腸桿菌大腸桿菌RNARNA聚合酶聚合酶 Escherichia Coli RNA Polymerase v大腸桿菌大腸桿菌7070啟動子啟動子 The E.coli 70 promoter v轉錄的起始轉錄的起始, , 延伸與終止延伸與終止 Transcription, initiation, elongation and termination 2轉錄轉錄:以以DNA為模板為模板,在依賴于在依賴于DN

2、A的的RNA聚合酶催化之下的一系列聚合酶催化之下的一系列RNA酶促合成過程叫做轉錄酶促合成過程叫做轉錄,包括包括RNA鏈的起始、延伸、終止等步驟。鏈的起始、延伸、終止等步驟。 v轉錄的基本原則轉錄的基本原則 Basic Principles of TranscriptionBasic Principles of Transcription3Antisense strandSense strandAntisense strandSense strand4v大腸桿菌RNA聚合酶 E.coli RNA Polymerase155kDa36.5kDa151kDa11kDa36.5kDa70kDaHol

3、oenzyme 全酶核心酶51 亞基: 核心RNA聚合酶有2個亞基,由rpoA基因編碼.功能：1）參與RNA核心酶的組裝,尚未發現有明確的轉錄功能。2）參與全酶和啟動子的牢固結合。3）當RNA聚合酶核心酶沿著模板移動進行RNA鏈的延伸時,保證DNA雙螺旋的不斷地在前面解開,在后面恢復雙螺旋。62 亞基: 是RNA聚合酶的催化中心, 由rpoB 基因編碼.可能含有兩個結構域, 分別負責轉錄的起始和延伸.具體是 ：結合核苷酸 底物并催化磷酸二酯鍵形成證據:(1)抗生素利福平:與亞基結合,阻止RNA聚合酶 轉錄的開始; (2)利迪鏈菌素也與亞基結合,抑制轉錄延伸.73 亞基:是RNA聚合酶的催化中心

4、，由rpoC 基因編碼, 負責核心酶與模板DNA的結合。 84 因子: 大腸桿菌中最常見的因子是70. 特性:（1）與核心酶結合形成了全酶,在啟動子識別中 起關鍵性的作用；（2）原核生物含有多種因子，以能識別各種類型的啟動子；（3）RNA鏈延伸至8-9nt時， 因子就離開核心酶；（4） 因子數量只有核心酶的30%，因此在任何時刻只有1/3的聚 合酶是全酶。95 亞基：亞基的功能尚不清楚,也有人認為亞基對于RNA聚合酶的結構和功能沒有太大的影響。10v 大腸桿菌大腸桿菌7070 啟動子啟動子 The E.coli 70 promoter1. 70在基因中的位置及序列為了方便為了方便, ,人們將人

5、們將mRNAmRNA開始轉錄的一個堿基開始轉錄的一個堿基( (轉錄起始點轉錄起始點) )定為定為+1,+1,沿轉錄方向順流而下均用正值表示沿轉錄方向順流而下均用正值表示; ;溯流而上的啟溯流而上的啟動子部分動子部分, ,均用負值表示。均用負值表示。112. 70的特征大小40-60bp; -10序列, 也叫pribnow框,含有保守序列 TATAAT, 其中帶底線的稱為保守T,它存在于目前已知的幾乎所有啟動子中,一般位于6(5)到9(8).該序列是聚合酶啟動DNA解旋的序列.122. 70的特征(續上) -35序列, 也叫Sextama框,也是RNA聚合酶覆蓋的部分。 RNA聚合酶依靠其亞基識

6、別該位點,因此又稱為RNA聚合酶識別位點。其保守序列為TTGACA。132. 70的特征(續上)啟動子區域的共同功能: (1) -35序列組成增強與聚合酶因子相識別和相互作用的識別區； (2) -10序列直接影響DNA的解旋速度；TTGACA.16-18bp.TATAAT5-8bp.CG/AT-35sequence -10sequence +114啟動子效率-10序列和-35序列之間距離的改變影響啟動子的活性。間隔17bp活性最強（16-18，15-20bp）弱啟動子沒有-35序列。如：lac啟動子，lac基因的表達需要一個輔助激活因子受體蛋白CAP(cyclic AMP receptor p

7、roteizod) 與靠近啟動子上的CRP位點結合，以增強啟動子與RNA聚合酶的結合從而進行轉錄起始。15v 轉錄的起始、延伸與終止 Transcription, Initiation , Elongation and Termination1 啟動子結合 Promoter binding2 DNA解旋 DNA unwinding3 RNA鏈起始 RNA chain initiation4 RNA鏈延伸 RNA chain elongation5 RNA鏈終止 RNA CHAIN TERMINATION6 依賴的轉錄終止 Rho-dependent termination161.Promote

8、r binding2. DNA Unwinding and initiation三聚復合物閉合復合物開放復合物3. ElongationDNA解旋區(轉錄泡)1712bp17bp3. Elongation18Termination (1)不依賴因子的轉錄終止(Rho-indepent termination)發夾結構特點:回文序列中富含G.C堿基對,在回文序列的下游方向又常有6個8個AT堿基對；1920(2) 依賴因子的轉錄終止 (Rho-depent termination)結合RNA上72個核甘酸發夾結構特點:依賴因子的終止子中回文序列的G-C對含量較少。在回文序列下游方向的序列沒有固定特

9、征,其A-T對含量比前一種終止子低。 21因子是RNA聚合酶的一種重要的蛋白質輔助因子。催化解開DNA-DNA和RNA-DNA雙螺旋結構。22q真核生物RNA的轉錄Transcription in Eukaryotesv真核生物的RNA聚合酶 Eukaryotic RNA Polymerases v真核生物的啟動子 Eukaryotic Promoter23v真核生物RNA聚合酶Eukaryotic RNA Polymerases 真核細胞中有三種真核細胞中有三種RNA聚合酶聚合酶：RNA聚合酶聚合酶I、RNA聚合酶聚合酶、RNA聚合酶聚合酶。除了這除了這3種聚合酶以外種聚合酶以外,真核生物細

10、胞中的線粒體真核生物細胞中的線粒體和葉綠體還含有其他的和葉綠體還含有其他的RNA聚合酶聚合酶243種RNA聚合酶的性質和功能TypeLocationFunctionTo -amanitinRNA Pol INucleoli核核仁仁Transcribes Most rRNAs geneInsensitiveRNA PolNucleo-plasm核質核質Transcribes all protein-coding genes and some snRNA genesVery sensitiveRNA Pol Nucleo-plasmtRNAs, 5S rRNA,U6 snRNA and other

11、 small RNAs genesModerately sensitive中度敏感中度敏感25RNA聚合酶亞基 RNA polymerase subunits三種聚合酶均含有12個以上的亞基,其中編碼每一個RNA聚合酶兩個大亞基的DNA序列具有同源.三種聚合酶均含有與E. coli RNA Pol 核心 ( 2)亞基相同 源的亞基. 其中最大亞基與E. coli RNA Pol 中的 亞基相似,第二大亞基與E. coli RNA Pol 的含有活性位點的 亞基相似.RNA Pol I 和III,共存兩個亞基,Pol II 專有亞基與E. coli RNA Pol 的 亞基具有同源性.至少還有5

12、種小亞基普遍存在于這3種聚合酶中,此外僅存在于某一特定聚合酶中的亞基還有4-7個.26 真核生物RNA聚合酶的活性Eukaryotic RNA polymerase activity 真核生物的RNA聚合酶與原核生物的共同點：（1）轉錄方向為53,合成與反義模板鏈互補的RNA（2）轉錄起始時不需要引物,只需要前體核苷酸ATP, GTP, CTP,UTP27真核生物的RNA聚合酶與原核生物的不同點：（1）有三個聚合酶。（2）真核生物RNA聚合酶在與啟動子結合、起始轉錄之前需要一些額外的起始蛋白（轉錄因子）的參與。（3） RNA 聚合酶II的羧基端含有一段7個氨基酸的重復序列，稱作羧基末端結構域，

13、即CTD (carboxyl terminal domain )；這7個氨基酸的重復序列是Tyr（酪）-Ser（絲）-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser。在老鼠中重復52次，在酵母中重復26次。這種結構對酶的活性是必要的。28真核生物的轉錄因子（1）基本轉錄因子（basal factor）（2）上游因子（upstream factor）（3）誘導因子（inducible factor）29v真核生物的啟動子 Eukaryotic Promoter啟動子：啟動子是指位于基因5 端上游，能夠被RNA 聚合酶和其他轉錄因子識別并與之結合，從而起始基因轉錄的一段DNA 序列，是基因表達調控中非常重

14、要的順式作用元件。 調控元件：順式作用元件(啟動子，增強子，沉默子），反式作用因子啟動子類型：I型啟動子、II型啟動子、III型啟動子301. rRNA 基因(rDNA)人類rDNA編碼產生一個45S的rRNA轉錄物 (13000nt)，這一轉錄物隨后被切成18S (2000nt), 5.8S (160nt) 和 28S (5000 nt)各1個的 rRNA. 人類細胞在不同的染色體上分布有5簇rDNA重復基因（串聯基因簇），每簇有40個拷貝，拷貝之間被非轉錄的間隔序列分開（圖）這種RNA多基因拷貝的連續轉錄是產生足夠且加工的rRNA。rRNA和蛋白質結合形成了核糖體(1) I型啟動子（ RN

15、A聚合酶I啟動子）3145S rRNAprocessed intorDNA32每一個rRNA簇被稱為一個核組織區域（nucleolar organizer regions）. 在rRNA合成活躍階段，前rRNA轉錄物與rDNA捆扎在一起可在顯微鏡下看到“圣誕樹” （Christmas tree structures）樣的結構.（圖） 332. I 型啟動子的特征I型啟動子由兩部分的轉錄控制區域構成:核心元件(Core element，CE) 和上游控制元件(Upstream control element, UCE)前 rDNA RNA Pol I promoters in human cel

16、ls34上游結合因子(Upstream binding factor1, UBF1)：一種特異DNA結合蛋白, 與UCE和核心元件上游的一段序列結合,UBF1可使轉錄速率大大增強.UBF1的兩個結合位點序列之間沒有明顯的相似性, UBF1的分子先結合一個序列元件,隨后通過蛋白-蛋白之間的互作結合,導致在兩個位點間的DNA形成一個環狀結構.3. RNA聚合酶與轉錄因子35選擇因子1(Selectivity factor1, SL1)：聚合酶I 轉錄所必需.SL1結合并穩定UBF-DNA復合物,且與核心元件游離的下游部分相互作用.SL1本身沒有與啟動子特異結合的特性,它促使Pol I與UBF-DN

17、A復合物的結合并起始轉錄.UBF1UBF13637(2) II型啟動子：RNA聚合酶II識別 RNA Pol II (RNA聚合酶聚合酶II)1）RNA Pol II 存在于核質中2）負責所有編碼基因和一些snRNA基因的轉錄3）合成的前mRNA需經過一系列的加工,如RNA 5端生成帽子結構、RNA 3端加上poly A 尾巴以及內含子剪接38 Typical RNA Pol II genes 39II型啟動子 Promoter特征： （1）TATA box：在上游約-25-35bp位置，有7對共有堿基序列5-TATA（A/T）A（A/T）-3。決定RNA Pol II 的位置或正確的起始轉錄

18、。（2）帽子位點（Cap site):即轉錄的起始位點，大都為A堿基。（3）CAAT box：即上游調控元件（UREs）。保守序列為GG（C/T）CAATCT，一般位 于-75bp附近。該序列確保啟動子的有效轉錄。A40其他真核生物的啟動子：（ 1）缺乏TATA框，只含起始元件，如老鼠的末端脫氧核苷酸轉移酶基因，其起始元件位于轉錄起始點附近，從-6至+11，序列為GCCCTCATTCTGGAGAC。（2）沒有TATA框，也不含起始元件，只有20-50bp的GC區。 這些啟動子的轉錄效率很低。41食用菌gpd啟動子：1 ATTCAAGCAGTCAATGGATTGGAGTGTATTTAGAATCG

19、AAGGTTGTGGAA51 CAAGGAAAAGATGCGGACGAAAAACACAACTGATCCTTTTATAGATAATC101 GCGCTTCAGTCAAATCTTGATTGCGTGATGTTGTGACTTCGACAATAGCC151 CTAAAGTCTAGACCTTAGAACACTTTAGTACCTCGGACCTGCGATTGGGT201 AGGATTTACTGGCCGAGTCCTTTGGGATGGACTGCCAATCAGCAAACGTT251 CTTCAGTTCTATCGCCCCATGACTAAGGTTGCCTGGAACCGTGCTCGAGC301 TTTGGATGGAAGTGC

20、CTTTGAAAAGCCCTGCAAAGTCTTGCAAATGCTAC351 AGCTTCCTCCCTGGCCTGGGTTTGTTGTTCTAGAACTACTCTCATTCTTA401 TCTTCTGCATACAACCATTTCATGCTATCCCAGGATACACCGGTTTCACC451 GTAGTAGCCTTATGGATGCAACTTTGACGCACTGACAATCTGACTGATAT501 CGACCAATAAGAATAGATAAAACTCCCTGTCCGAGTCCTTTCCGTGATAC551 ATGTGGCTCTCCGACTGCACTCTAACGCCGATAGGATACGGGCCC

21、GCTCA601 GATAACCAGCA42uGfp基因在灰蓋鬼傘菌絲中的表達ck- pLg-gfp轉化子Lg2 pGg-gfp轉化子Gg1 普通光源藍光激發ck- pLg-gfp轉化子Lg2 pGg-gfp轉化子Gg1 l熒光顯微鏡下的菌絲熒光圖43ck- pLg-gfp轉化子Lg2 pGg-gfp轉化子Gg1 pLr-gfp轉化子 Lr1l共聚焦顯微鏡下菌絲熒光圖片44Fluorescence microscope45u增強子Enhancer ：在遠離轉錄起始點（上游或下游）的一段可增強啟動子活性的調控元件，大小為100-200bp。最初在DNA病毒SV40的基因組中發現。特性：（1）加強

22、相連基因從正確起始位點的轉錄活性；（2）增強子無論是在下游或在上游均可激活轉錄；（3）無論是在下游或在上游，可在遠離起始位點1Kb以上發揮作用；（4）兩個啟動子串聯在一起時，增強子優先激活距離最近的那一個。u沉默子Silencer:46 IIII型基因轉錄的轉錄因子和轉錄起始復合物型基因轉錄的轉錄因子和轉錄起始復合物轉錄因子：真核生物RNA聚合酶轉錄需要的各種蛋白質輔助因子稱之。以TFIIX表示，以發現順序命名，如：TFIIA、TFIIB等。轉錄起始復合物的組裝過程：p268-26947（3）III型啟動子：RNA聚合酶III識別 RNA聚合酶聚合酶III:1）Contains at leas

23、t 16 different subunits2）Located in nucleoplasm(核質核質)3）Synthesizes the precursor of 5S rRNA, the tRNAs and other snRNAs and small cytosolic(胞質胞質) RNAs III型啟動子的類型（下圖）：基因內啟動子轉錄起點上游啟動子48 Promoters for RNA polymerase IIIMay consist of bipartite(雙向的) sequences downstream of the startpoint, with boxA sepa

24、rated from either boxC or boxB. Or they may consist of separated sequences upstream of the startpoint (Oct, PSE, TATA box).5SrRNA基因U6等基因tRNA基因49tRNA 的基因內啟動子(1) Transcription control regions (promoters) of tRNA lies after the start site.(2) Two highly conserved sequences within the tRNA coding region

25、, called A box (5-TGGCNNAGTGG) and B box (5-GGTTCGANNCC). These sequences also encode important sequences in the tRNA itself, the D-loop and T C-loop (tRNA二級結構形式二級結構形式).Highly conserved sequence in tRNAs are also highly conserved promoter DNA sequences. 50(3)Two complex DNA-binding factorsa. TFIIIC

26、binds to both the A and B boxesb. TFIIIB: the true initiation factorbinds 50 bp upstream from the A box.Consists of 3 subunits, including TBP, BRF and BTFIIIC remove without affecting transcription51v轉錄的終止Transcriptional termination RNA polymerases III 的終止只需要一個簡單的核苷酸序列, 這個核苷酸序列由成簇的dA殘基構成, 但其終止序列受到周圍

27、的序列的影響.如Xenopus borealis體細胞中5SrRNA基因的一個有效的終止信號, 其序列為: 5-GCAAAAGC-3 其他終止信號可能也是U序列的發夾結構和富含 G-C的區域。52qRNA轉錄的抑制作用RNA的轉錄抑制劑有三類：（1）嘌呤和嘧啶類似物:53（）（）DNA模板功能的抑制物模板功能的抑制物: 1）烷化劑：氮芥、磺酸酯、氮丙啶、乙撐亞胺。）烷化劑：氮芥、磺酸酯、氮丙啶、乙撐亞胺。 2 ）放線菌素：）放線菌素： 3）嵌入染料：溴化乙錠等）嵌入染料：溴化乙錠等（3）RNA聚合酶的抑制物：聚合酶的抑制物： 1）利福利福平平霉素：利福平霉素：利福平 2）鏈霉素）鏈霉素 3）-

28、鵝膏蕈堿鵝膏蕈堿 4）放線菌素）放線菌素54作業：1）術語解釋：轉錄、模板鏈、轉錄泡、啟動子、增強子、 沉默子。2）真核生物的RNA聚合酶與原核生物的RNA聚合酶有哪些 異同點？3）簡述原核生物的啟動子的結構特點。4）簡述真核生物的啟動子類型及其結構特點。5）原核生物和真核生物的轉錄是如何終止的？553 亞基:是RNA聚合酶的催化中心，由rpoC 基因編碼, 負責核心酶與模板DNA的結合。 56Termination (1)不依賴因子的轉錄終止(Rho-indepent termination)發夾結構特點:回文序列中富含G.C堿基對,在回文序列的下游方向又常有6個8個AT堿基對；57因子是RNA聚合酶的一種重要的蛋白質輔助因子。催化解開DNA-DNA和RNA-DNA雙螺旋結構。582. I 型啟動子的特征I型啟動子由兩部分的轉錄控制區域構成:核心元件(Core element，CE) 和上游控制元件(Upstream control element, UCE)前 rD