1、RNA 干擾(RNA interference , RNAi)是由雙鏈 RNA(double strandedRNA, dsRNA 汾子在 mRNA 水平關閉相應序列基因表達或使其沉默的過程。dsRNA 可以抑制不同類型細胞的靶向基因表達，用特異性的抗體幾乎檢測不到靶向基因所表達的蛋白質。因此，RNAi 技術又被形象地稱為基因敲除(knock out)或基因沉默(gene silencing)o1 RNAi 技術的發展過程早在 1990 年，植物學家 Jorgeen 等人用矮牽牛花做試驗，探生網 將紫色素合成基因導入植物體，嘗試將更多拷貝的色素基因注入植物體，使花朵的色 彩更加艷麗。結果許多花

2、朵沒有開出更艷麗的花朵，反而開出白色的花朵。 進一步分析發現，這些轉入的基因不但自身沒有表達為蛋白質，反而關閉了牽牛花中與其 同源的色素相關基因的表達。由于這種由外源基因的導入而造成的抑 制作用最初被確認是發生在轉錄后水平，稱這種現象為共抑制(cosureion)2。1994 年，Cogoni 等人將外源性類胡蘿卜素基因導入野生型粗糙鏈抱霉菌，結果 轉化細胞中內源性的類胡蘿卜素基因也受到了抑制，他們稱這種基因失活形式為消除作用或基因壓制(quelling)3。1995年康乃爾大學的 GuS博士在實驗中想 通過反義 RNAffi 斷美麗線蟲(C. elega)的 par-1 基因表達，同時還用正

3、義 RNA 做了一個對照，試圖觀察到對照試驗組基因表達增強的現象，但結果卻發現了反 義和正義 RNMK 阻斷了 該基因的表達，Guo 等人一直不能解釋該現象。直到 1998 年 Fire等5才發現這是由于 Guo 博士在試驗中污染了雙鏈 RNAW 引起的。他們 還證明轉錄得到的單鏈 RN%純化后注射線蟲所引起的阻斷作用十分微弱，而經 純化的雙鏈 RNAM 能高效特異地阻斷相應基因的表達，他們將此現象稱為RNA十擾。1999 年，Hunter6等 的實驗進一步驗證了 RNAi 的存在。他們將 dsRNA 去除后，再將正義或反義的 RNAft 入線蟲卵中，沒有產生基因沉默現象。相反， 如果將上述正

4、義及反義 RNA 混合，經退火復性后得到的 dsRNAS入線蟲卵中可 以顯著地產生基因沉默現象，從而印證了Fire等提出的 RNAi 作用是由 dsRNA引起的結論。2000年首次在果蠅中發現，通過核糖核酸酶可將長的dsRNAft 理為 2123 nt 的短片段。2001年，首次報道了哺乳動物細胞中也有 RNAi。2002 年證明了用短的發夾結構 RNA(shRNA 在哺乳動物細胞中可以誘導特異性的基 因沉默7。 2003年首次用 RNAi 技術對模型動物進行了治療研究8。2006年諾貝 爾醫學獎沒有堅持研究成果要經過數十年實踐驗證的“慣例”，破格授予美國科學家安德魯？菲爾和克雷格？梅洛，以表

5、彰他們 1998年發現了 RNAi 現象。此后， 人們在不同種屆的生物中進行了廣泛而深入的研究，結果證實 dsRN導的 RNAi現象存在于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、渦蟲、水 螟、斑馬魚、小鼠、大鼠、 猴乃至人類等多種生物中2。2 RNAi 的作用機制目前關于基因沉默的假說認為，轉錄后水平的基因沉默，主要包括起始階段、效 應階段和倍增階段。2. 1 起始階段外源性導入或由轉基因、轉座子、病蠹感染等多種方式引入雙鏈核糖核酸(dsRNA), 在細胞內特異性與 RN硼 m (RNAas 曲核酸內切酶)Dicer結合，dsRNA切割成 2123nt 長度的帶有 3端單鏈尾巴及磷酸化的 5端的短鏈 dsR

6、NA 即小十擾 RNA(siRNA (以下圖片均來自于陳莉等的文章在醫藥領域中RNAF 擾研究進展)2.2效應階段雙鏈 siRNA 可以與含 Argonauto (Ago)蛋白的核酶復合物結合形成 RNAW 導沉 默復合體(RNA-induced silencing complex , RISQ 并被激活。在 ATP 供能情 況下，激活的 RISC將 siRNA 的雙鏈分開，RISC 中核心組分核酸內切酶 Ago 負責 催化 siRNA 其中一條鏈去尋找互補的 mRNAl,然后對其進行切割。反義鏈先與 同源 mRN/K對結合，然后 RISC在距離 siRNA 3端 12 個堿基的位置將 mRN

7、AU 斷降解，從而阻止靶基因表達，使基因沉默9。2.3倍增階段siRNA 在 RN 嵌賴性 RN 承合酶(RdRP)的作用下，以 mRN 削模板，siRNA 為引 物，擴增產生足夠數量的 dsRNA 作為底物提供給 Dicer 酶，產生更多的 siRNA, 可再次形成RISC,并繼續降解 mRN 戒而產生級聯放大效應。并作用于靶 mRNA 如此反復倍增，從而使 RNAi 的作用進一步放大。 因此少量的 siRNA 就可以產生 高效的基因沉默效果10。3 RNAi 的設計及合成3.1 siRNA 的設計設計高效率的 siRNA首先要通過 NCBk DDBJ BMB 區 3個基因序列數據庫，檢 索

8、相關的基因序列，獲得靶向 mRN 威 cDNAff 列，再就是合理設計 siRNA。常 規 siRNA 的設計原則是以成熟的 mRN 的標準，若以 DNAff 列為參照，則最好選 擇 cDNA 專錄區+50到+100 以后的 下游序列，兩端的非翻譯區不作為 siRNA 設計 依據。siRNA 二聚體的正義鏈和反義鏈各含 21nt 為佳，3端為突出末端。3凸 端為尿苜(U) , 5凹端為腺苜(A)的 mRN 舟列應作為首選。進行 Gen-BankBLAST 查詢，確保所選 siRNA 編碼不與其它基因同源11。不是 mRNAj 所有業單位都能 形成有效的 siRNA,大約有 60%7。宛以發揮沉

9、默效應，這是由于 5 和 3 -UTR 有豐富的調控蛋白結合區域，產生 UTR 結合蛋白或翻譯起始復合物均可能影響 RISC 結合 mRNA 從而影響 siRNA 的效果，所以沉默效應率差異較大，針對一個 靶基因需要設計 34 條 siRNA,以保證能夠篩選出一條有效序列12。3.2iRNA的合成方法制備 siRNA 的方法主要有化學合成法、體外轉錄法、酶消化法、體內轉錄法等。當已經找到最有效的 siRNA 時，適合以植苜酸單體為原料，通過化學方法合成兩 條互補的長約 2123 nt的 RNAI 鏈，然后退火形成雙鏈復合體，這種方法所獲 得的產物純度、十擾效率高，合成簡單，但是制備周期長，作用

10、時間短，而且價 格昂貴限制了其應用和推廣13。體外轉錄法14是以兩段互補的 DN隅棋板，在 針對靶序列的正義鏈和反義鏈上游接上 T7 啟動子， 使用 T7 RN麻合酶， 各自在 體外轉錄獲得兩條單鏈 RNA將兩條單鏈退火后形成雙鏈 RNA 然后用 RNAB 消 化，所得產物經純化后就是所需的雙鏈 RNA 此方法適用于篩選有效的 siRNA, 但不適用于對特定 siRNA 進行長期研究。酶消化法15是先在體外化學合成 2001000完整的目的基因長片段 dsRNA 用細胞內形成的 siRNA 關鍵酶-Dicer 酶或者 RNas由進行消化，即可得到各種不同的針對同一目的基因的不同位點的 siRN

11、A 混合物，然后將混合 物轉染至細胞內，能得到較高的抑制效率。該方法 抑制率高，且省時省力，但此法產生的混合物可能導致非特異性抑制，另外在體外轉錄長鏈 RNM 困難,Dicer酶費用較高16,此方法不適用于長時間的研究 項目，或者是需要一個特定的 siRNA 進行研究，特別是基因治療。體內轉錄17是將 siRNA 的質粒、病蠹表達載體或帶有 siRNA 表達盒的 PCFT 物轉入細胞，由 細胞表達產生 RN 時擾作用0sirna表達載體常用能在哺乳動物細胞中表達 shRNA 的含有RN麻合酶m (poim)啟動子的載體18,通過轉染含有 RN寐合酶II/III 的啟動子 U6或 H1,及其下游一小段特殊結構的質粒或病蠹載體到宿主細胞內， 轉錄出 shRNA 該 RNM 細胞內被 Dicer酶剪切成 siRNA 而發揮作用。該方法的 優點是細胞特異性強，適用于基因功能的長時間研究2。siRNA 表達框(siRNAexpreion caettes , SECs)17是 一種由 PCRU 備的 siRNA 表達棋板，可直接轉 入細胞進行表達而無需事先克隆到載體中。利用引物延伸法進行PCR 產生