1、實驗二、葡聚糖凝膠柱層析1、目的與要求：1.1、學習凝膠(Gel)層析法的基本原理；1.2、掌握葡聚糖凝膠（Sephadex）柱層析的操作技術。2、概述及原理：凝膠是一類不溶于水，在水中卻有較大膨脹度和較好的分子篩功能，具有立體網狀結構的物質（如葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等）。 2.1、能用于層析的凝膠主 要有下面幾種：目前主要有葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex），天然瓊脂糖凝膠（商品名為Sapharose）、聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio-Gel），其后還發展了凝膠的各種衍生物，如羧甲基-交聯葡聚糖（CM-Sephadex），二乙基氨乙基-交聯葡聚糖（DEAE- Sephadex）等種類

2、。 交聯葡聚糖凝膠 ：是凝膠層析法中使用最廣泛的一類層析凝膠，商品名稱：SephadexSephadex。其基本骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖殘基通過1，6糖苷鍵連接而成，葡聚糖分子之間通過醚橋（甘油基）交聯形成三維空間網狀結構 2.2、不同型號的葡聚糖凝膠(Sephadex) 的選用原則： 組別分離時，Sephadex G25最為常用。例如樣品中緩沖液的更換，蛋白質的脫鹽 ； 分級分離時（如多蛋白質組分樣品的分離純化），應根據待分離樣品中各組分的分子量大小和分子量分布范圍來確定型號。 2.3、凝膠層析法的原理：凝膠層析是一種液相層析，機理是分子篩效應。當洗脫開始以后，小分子可進入凝膠顆粒內部

3、，流程長，流動慢；大分子不能進入凝膠顆粒內部，流程短，流動快。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小“排隊”，凝膠表現分子篩效應。 層析柱的重要參數 ： Vt(total volume) Vo(outer volume)Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+KdVi。組分的洗脫體積（Ve）：當樣品的體積很少時（與洗脫體積比較可以忽略不計） ，在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。 當樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當樣

4、品體積很大時，洗脫體積計算可以從應用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點（或半高處）。 Kd是分配系數：用于衡量兩個物質的分離分辯率，是凝膠層析的一個特征常數，只與被分離物質分子大小和凝膠孔徑大小有關，與層析柱的長短粗細無關。Kd值的計算：Kd=(Ve-Vo)/Vi幾個特征Kd值意義： Kd=0,則Ve=Vo ，全排阻； Kd=1,則Ve=Vo+Vi , 全摻入； 0Kd1，則VeVo+Vi ，如某些芳香族化合物（Phe,Tyr,Trp等），Sephadex G-25對它們有吸附作用。 2.4、影響凝膠層析分離的因素：2.4.1、樣品的體積、粘度； 2.4.2、層析柱 ；2.4.3、洗脫液流速的影響

5、；2.4.4、洗脫液離子強度、PH的影響。 2.4.1、樣品的體積、粘度： 分析分離時，Vsample=1-4%Vbed； 制備分離時，Vsample=10-30Vbed. 相對粘度 樣品液粘度與洗脫液粘度的比值。分離效果只與相對粘度有關，一般來說，相對粘度不得超過1.52。 今天的上樣量（0.4ml）約為1%柱床體積。2.4.2、層析柱： 柱長：組別分離時，2030厘米；分級分離時，可長至100厘米；柱徑：柱長與柱徑的比為5:110:1(脫鹽)，20:1100:1 (純化) 。今天選用的是1cm 30cm的層析柱。2.4.3、洗脫液流速的影響： 洗脫液的流速與樣品分離的分辨率相關。流速過快，

6、會使色譜峰變形，流速過慢，樣品擴散傾向加劇。一般流速控制在30200ml/h。 今天洗脫流速控制在1ml/min。2.4.4、洗脫液的離子強度和pH值的影響： 純化蛋白時,通常選用離子強度0.02的鹽溶液作洗脫劑，以增加樣品的溶解度和消除凝膠的吸附作用；酸性組分應選用偏堿性洗脫液；堿性組分應選用偏酸性洗脫液。2.5、凝膠層析法的應用：1、生物分子的分離提純； 2、測定高分子物質的分子量 ；3、脫鹽工具； 4、高分子溶液的濃縮 ；5、用于去除熱原物質 。2.6、凝膠的防腐、保存： Sephadex、Sepharose等都是多糖類物質，易于長菌，因此常在凝膠（不用時）中加入抑菌劑，使用時再除去。常

7、用0.02疊氮鈉或20%乙醇溶液作防腐劑。1厘米光程時，254nm處透光率為60， 280nm處透光率為100。3、試劑、器材：3.1、層析介質 Sephadex G-50；3.2、樣品（包含三個組分）：藍色葡聚糖2000， 溶菌酶， Trp 上樣量：0.4ml/柱。3.3、洗脫液：0.15M氯化鈉，即生理鹽水。3.4、層析系統：層析柱、恒流泵、部分收集器、核酸蛋白檢測儀、記錄儀。 4、實驗操作過程：4.1、凝膠的溶脹4.2、裝柱；4.3、上樣； 4.4、洗脫和收集。 4.1、凝膠的溶脹： 將稱好的凝膠干粉投入燒杯中，加以適量洗脫液，沸水浴溶脹2小時（也可室溫24小時）。沸水浴溶脹的好處：省時

8、，還可消毒，驅除凝膠顆粒內部的氣泡。 4.2、裝柱： 流程： 4.2、裝柱： 裝柱：干凈的層析柱調整固定在垂直狀態，柱內裝放適量洗脫液，排除下接頭處濾膜下的空氣泡，關閉出口，柱內存留四分之一床體積的洗脫液，加入攪拌均勻的凝膠漿液，打開出口，控制流速，凝膠隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉隆到層析柱底部，不斷補充凝膠漿液至膠面上升至層析柱上部，注意凝膠面上應始終保持有洗脫液。調節流速1ml/min。床面上覆蓋尼龍膜或濾紙（對操作熟練者不需要而且不放更好）。4.3、上樣： 上樣前柱子要平衡。打開上接頭，用吸管吸去床面上大部分洗脫液，當洗脫液面接近凝膠床面時，關閉層析柱出口端，用吸管吸取樣品混合液0.4毫升，沿管壁小心加樣于柱床表面，打開層析柱出口端，待樣品完全摻入膠內，開始收集流出液，同時小心加滿洗脫液，連接好層析柱上接頭，通過泵控制流速：1ml/min。 樣品中組分的分子量差異特別大，顏色也不一樣，可使同學們直觀地觀察