1、節下面內容綜合了 Agilent和網上查到的一些資料：一般來說，反相 HPLC的流動相包括有機相和水相，有機相常用的為色譜甲醇和乙睛，不太常用的還有四氫吠喃和異丙醇。甲醇有其性價比的優勢，但是甲醇活性高，可能與某些樣品發生反應，而且甲醇在低波長下有紫外吸收，會降低分析方法的靈敏度；乙睛雖然價格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強，很少與樣品發生反應，用作流動相系統壓力要比甲醇低很多，且截止波長比甲醇低20nm,增加了檢測出在低波長下才有吸收的雜質的可能性，所以我們一般傾向于多用乙睛，少用甲醇。但是當樣品峰形不好或者分離不好時，更換溶劑是一個很好的選擇，因為不同的溶劑可提供不同的選擇性。在反

2、相色譜中，流動相中水相的pH和離子強度在開發對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物，典型樣品的保留隨pH改變而明顯變化，因此控制 pH對于保留和選擇性的穩定非常重要，通常在pH24的條件下，保留時間對 pH的微小改變穩定性最高，因此建議將這一pH范圍作為大多數樣品方法開發的起始pH,包括堿性化合物和一般的弱酸。考慮到重現性，所用的 pH應高于或低于待分析物 pKa或pKb上下一 rTp / -.I's n，個pH單位。當待分析物 pKa或pKb未知時，應測試一種以上流動相pH (如pH2.0和pH6.5緩沖鹽溶液)，可提供最好結果。對流動相的優化主要體現在水相上。流

3、動相pH值對色譜分離的影響有多鐘方式，根據待分析物的結構性質，»I '|,t；| IpH可能影響選擇性、峰形和保留。如果是非極性較強或中性的化合物，pH對分離度和保留的影響一般不明顯。1II1I如果是可離子化的化合物，如酸或堿，保留因子和選擇性隨pH改變非常明顯。(1)酸性分析物，應選擇低 pH緩沖液流動相，以防止分析物離子化。了解分析物的pKa ,才能有效的選擇流動相pH。緩沖范圍應在其緩沖液離子pK值±pH單位，使流動相的優化具有一定的靈活性。例如，醋酸鹽的pKa為4.8,緩沖范圍為 pH3.85.8 。(2)堿性化合物，在高 pH條件下才能得到其非離子形態，但

4、這對色譜柱不利。通常許多堿性化合物在低pH條件的保留就已經滿足要求了，所以可選擇低pH條件。如果選擇高 pH條件，則注意需選擇耐強堿的色譜柱。水里可以加酸、加堿、加鹽，從而改變pH值、改善峰形、提高分離度。常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等。單純做液相時，低波長下磷酸最合適；而做液質時首選三氟乙酸，或甲酸、乙酸。開發液相分析方法時流動相可首選0.1%的磷酸水溶液，然后再以此為基礎做優化。在單獨用酸不行的時候再考慮使用緩沖鹽，緩沖鹽的選擇原則是：簡單、穩定、緩沖能力強、配制簡單，需要調pH值時要有相應的酸或堿。常用的緩沖鹽是磷酸鹽，主要是鉀鹽和鈉鹽，還有醋酸鹽，常用的鹽濃度

5、在1020mM左右(根據實際情況，有時可以選擇更低或更高濃度，建議最高濃度不超過50mM ）。卜表是 Waters提供的一個資料，常規實驗室建議使用的緩沖鹽體系。聿緩沖鹽/流動相 改性劑螂pKa索緩沖范圍星揮 發 性 ?（土 pH）腿是否MS兼容？聿備注蟆TFA肄0.3羋-滕是裂離子對試劑，能夠抑制 MS信號，通常使用的濃 度范圍0.020.1%芨乙酸薇 4.76贛-是是同乙酸先用使用具有 最大的緩沖能力，通常使 用的濃度范圍0.11.0%甲酸3.75-是是同甲酸先用使用具有 最大的緩沖能力，通常使 用的濃度范圍0.11.0%乙酸鹽（錢鹽）4.763.765.76是是通常使用110mM濃度，

6、注意鉀鹽和鈉鹽是非揮 發性的甲酸鹽（錢鹽）3.752.754.75是是通常使用110mM濃度， 注意鉀鹽和鈉鹽是非揮 發性的磷酸鹽12.151.153.15否否傳統的低pH緩沖體系，UV透光度很好磷酸鹽27.26.28.2否否當pH超過7時，降低操 作溫度/緩沖鹽濃度以及 使用保護柱可以延長色譜柱壽命磷酸鹽312.311.313.3否否當pH超過8時，降低操 作溫度/緩沖鹽濃度以及 使用保護柱可以延長色 譜柱壽命4-甲基 嗎啡咻8.47.49.4是是通常使用濃度為10mM 或更少氨水 碳酸氫 俊9.210.3(H_ _ 一CO3)9.2(NH4+)8.210.28.211.3是是通常使用濃度為

7、510mM （用于MS工作 時保持離子源溫度超過150 C） 0用氨水或乙酸|調節pH值，在pH10時 具有很好的緩沖能力。乙酸俊9.28.210.2是是通常使用濃度為110mM甲酸俊9.28.210.2是是通常使用濃度為110mM硼酸9.28.210.2否否降低溫度，減少濃度并使 用色譜柱來延長柱壽命CAPSO（3-環 己胺基-2-羥基 丙磺酸9.78.710.7否否兩性離子緩沖液，同乙月青 互溶,通常使用濃度為 110mM ,氣味小Glycine甘氨酸2.4,9.88.810.8否否兩性離子緩沖液，比使用 硼酸鹽對柱子的損傷更 小些1-甲基哌噬10.29.311.3是是通常使用濃度為110mMCAPS10.49.511.5否否兩性離子緩沖液，同乙月青 互溶,通常使用濃度為 110mM ,氣味小三乙胺 （乙酸 鹽）10.79.711