1、重組PP150抗原用于膠體金免疫斑點技術檢測抗HCMV 作者：王清,王錫波,徐龍強,于維林,于紅,張文卿【關鍵詞】 巨細胞病毒 Recombinant PP150 of human cytomegalovirus as antigene for colloidal gold immunodot assay to detect HCMVIgM in sera【Abstract】 AIM: To use recombinant pp150 of human cytomegalovirus (HCMV) in colloidal gold immunodot assay (CGIDA) for th

2、e detection of HCMVIgM in sera. METHODS: A fragment of gene coding for pp150 antigen epitopes (840-1048aa) was expressed in E. coli and the fusion protein was purified. The results were compared with those of specific antibodies ELISA IgM. RESULTS: Recombinant antigen CGIDA had a good agreement (96.

3、0%) with ELISA kit. The specificity of CGIDA was 100% and the sensitivity was 74.2%. CONCLUSION: Recombinant pp150 is an effective and valuable antigen used in CGIDA for detecting HCMVIgM.【Keywords】 cytomegalovirouses,human;gene pp150;prokaryotic expression; gold colloidal; immunodot assay【摘要】 目的: 探

4、索應用重組人巨細胞病毒(HCMV)PP150抗原用于免疫滴金技術檢測血清中抗HCMVIgM的診斷價值. 方法: PCR擴增HCMV pp150抗原決定簇（8401048aa）編碼基因片段，插入原核表探索應用重組人巨細胞病毒(HCMV)PP150抗原用于膠體金免疫斑點技術（CGIDA）檢測血清中抗HCMVIgM的診斷價值. 達載體pMAlp2，轉化宿主菌E.coli，誘導表達及純化. 重組抗原CGIDA與酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒對比檢測. 結果： 重組抗原CGIDA與ELISA試劑盒比較,符合率達96.0%；CGIDA檢測HCMVIgM的敏感度為74.2%，特異性為100%. 結論:

5、 重組抗原pp150用于 CGIDA對HCMV的早期診斷，具有較好應用價值.【關鍵詞】 巨細胞病毒, 人；基因pp150;原核表達；膠體金;免疫斑點法0引言膠體金免疫斑點法(colloidal gold immunodot assay,CGIDA)快速簡便，呂貫廷等1成功地建立了CGIDA檢測HCMVIgG的方法，但國內關于抗人巨細胞病毒(HCMV)IgM的臨床檢測的報道較少. 我們用基因工程方法合成HCMV pp150（8411084aa）抗原,以膠體金為標記手段,建立了檢測血清抗pp150 IgM抗體的膠體金免疫斑點法.1材料和方法1.1材料HCMV AD169毒種、宿主菌E.coli D

6、H5, 原核表達質粒pMAlp2為山東省分子病毒學重點實驗室提供. EcoR I, Hind, T4 DNA Ligase, Wizard PCR Preps DNA Purification System, Wizard Plus Minipreps DNA Prurification Systems, IPTG, 硝酸纖維素膜（孔徑0.65 m）等均購自Promega公司. 麥芽糖結合蛋白(MBP)純化樹脂購自BioRad公司. 抗人IgM及HCMVIgM ELISA試劑盒由山東省分子病毒學重點實驗室提供. HCMV IgM陽性血清120份經青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產科研究室提供（晶美生物

7、工程有限公司人巨細胞病毒IgM ELISA試劑盒檢測）; 266份臨床血清采自青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院正常孕婦. 正向引物： 5TGGCGAATTCACCTCTTCCGCTTCTTCGGC3，反向引物：5GTGTTAAGCTTCTATTCCTCCGTGTTCTT3，PCR產物長度為651 bp,產物上游酶切位點為EcoR1，下游酶切位點為Hind.1.2方法1.2.1重組pp150抗原的制備HCMV AD169株接種人胚肺二倍體細胞，待細胞出現(xiàn)病變()后，收集細胞，提取總DNA作為模板，通過PCR擴增出HCMV pp150多個強抗原決定簇區(qū)目的基因. 分別用限制性內切酶EcoR I, Hind酶

8、切上述擴增片段和質粒pMALp2，回收酶切產物和載體片段，然后進行連接反應. 將連接產物轉化感受態(tài)宿主菌E.coli DH5，挑取經鑒定的單個菌落，37培養(yǎng)至A600 nm約為0.5. 加ITPG分別誘導1, 2, 3, 4, 5 h后收集菌體，在50 mmolL TrisHCl（pH 8.0）溶液中超聲波裂解（12 s/次，共3次），將沉淀溶于包涵體溶解緩沖液中(8 molL尿素，100 mmolL NaCl，1 mmolL EDTA，0.1 mmolL PMSF，50 mmolL TrisHCl，pH 80)，4, 6000 g離心10 min，回收上清. 每隔1 h用復性液(10 mmo

9、lL GSH， 2 mmol/L GSSG，50 mmolL TrisHCl，pH 80),將尿素濃度逐步降低到0.5 mmolL，4復性過夜，在透析液(50 mmolL TrisHCl，pH 8.0)中4充分攪拌去除剩余尿素. 4, 6000 g離心10 min，取上清，復性蛋白15 mL (05 gL)上樣，用麥芽糖結合蛋白（MBP）純化樹脂純化（具體操作見說明書）. 應用150 g/L SDSPAGE檢測表達及純化情況.1.2.2CGIDA試劑盒的置備及檢測方法在300 mL雙蒸水中加入10 g/L枸櫞酸鈉4.5 mL，煮沸后迅速加入0.2 g/L氯金酸3.6 mL ，繼續(xù)煮沸1015

10、min，冷卻后用0.1 mol/L碳酸鉀調pH值至8.5；取已純化抗體作線性稀釋，每管加入制備好的膠體金溶液1 mL，靜置2 h,以保持紅色不變的最小量管為膠體金與待標記蛋白的最適比例；取已純化的抗原多肽與水溶性碳化二亞胺活化過夜，用PBS透析1 d；以3 mL膠體金溶液為基準，加入抗人IgM迅速混勻，15 min后加入10 g/L穩(wěn)定劑7.5 mL，混勻，以1000 g 10離心40 min，棄上清夜，沉淀重懸于等體積10 g/L穩(wěn)定劑(pH 7.27.4)中，1000 g 10離心30 min，棄上清液，沉淀用1/5體積恢復液恢復. 用孔徑為0.65 m的硝酸纖維素膜制成1 cm直徑的方片

11、， PP150蛋白、HCMVIgM（陽性對照）、PBS（陰性對照）3×3的點陣滴定后，將活化抗原稀釋至濃度為0.25 mg/L，直接滴加于載體膜上，室溫干燥后用10 mL/L牛血清白蛋白（BSA）封閉，再用10 mol/L PBS洗滌3次，干燥后于4中保存. 將已涼干的抗原膜片裝入塑料小盒中，盒內充滿吸水材料；在膜盒的中央分別滴加血清標本,人HCMVIgM, PBS各15 L，待滲入后用10 mol/L PBS洗滌3次，加入膠體金標記抗人IgM,觀察結果，陽性者在膜中央出現(xiàn)紅色斑點，陰性者則無紅色斑點形成. HCMVIgM ELISA的檢測按試劑盒說明書操作. CGIDA檢測120份

12、HCMVIgM陽性血清標本，同時檢測100例單純皰疹病毒型IgM陽性血清標本. 免疫斑點檢測試劑在4下放置6 mo,每月檢測抗HCMVIgM陽性及陰性血清各30份. 于37和4均放置1 wk,然后分別檢測陽性和陰性血清各50例作穩(wěn)定性試驗.2結果2.1目的基因的PCR擴增PCR擴增產物長度為651 bp，其中目的基因為624 bp，擴增產物兩端引入限制性內切酶識別位點序列、保護性堿基共27 bp. 核苷酸片段大小與預期值一致，陰性對照未增出特異性片段（Fig 1）.2.2原核重組表達質粒的鑒定少量堿裂解法快速提取重組質粒經EcoR I及Hind雙酶切后電泳見2條帶,分別約為6.7 kb和624

13、 bp，與預測結果一致，證明重組克隆成功（Fig 2）.2.3SDSPAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍染色鑒定重組蛋白的檢測分析菌體裂解液，表明誘導表達產物主要存在包涵體中. SDSPAGE蛋白電泳顯示pMAlP2PP150克隆全菌裂解物在Mr 64 000的位置出現(xiàn)一條蛋白條帶，而未誘導的重組質粒轉化菌在相應位置的無蛋白條帶；含質粒pMAlP2的誘導菌則在Mr 43 000位置出現(xiàn)一條帶. 電泳結果與理論預測值相一致. 另外，從蛋白帶型來看，誘導5 h的融合蛋白表達量最高，經凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，融合蛋白含量占全菌體的10%. 純化的融合蛋白經SDSPAGE及考馬斯亮藍染色后，融合蛋白Mr 64

14、000位置出現(xiàn)一清晰蛋白條帶，pMALp2轉化菌誘導表達的MBP則出現(xiàn)于Mr 43 000位置.2.4重組蛋白的抗原性隨機挑選15份IgM陽性患者血清進行Western印跡檢測，其中12份與表達的融合蛋白有反應，檢測的20份IgM陰性血清均為陰性，表明此融合蛋白識別IgM特異性抗體的識別率為80%. 陽性血清與MBP無反應.2.5CGIDA檢測HCMV IgM純化重組抗原CGIDA檢測正常孕婦血清標本266份，其中14份陽性，陽性率為5.3%，與ELISA試劑盒檢測陽性率為6.0%比較，符合率為96.0% （Tab 1）.表1重組抗原CGIDA與ELISA檢測結果比較（略）2.6CGIDA檢測

15、HCMV IgM敏感性與特異性HCMV IgM陽性血清標本120份中，檢出陽性標本89例，同時檢測100例單純皰疹病毒型IgM陽性血清標本，結果均為陰性. 可見，重組抗原CGIDA檢測HCMV IgM方法的敏感性為74.2%，特異性為100%. 免疫斑點檢測試劑在4下放置6 mo,每月檢測抗HCMV IgM陽性及陰性血清各30份,其特異性和敏感性非常穩(wěn)定. 于37和4均放置1 wk,然后分別檢測陽性和陰性血清各50例,二者差異沒有顯著性.3討論血清特異性IgM檢測是診斷急性或活動性HCMV感染的重要方法，但是由于迄今采用的抗原仍是通過細胞培養(yǎng)獲得的全病毒抗原，而HCMV病毒本身含有與單純皰疹病

16、毒和細胞膜成份(mp60)等的交叉抗原,病毒雖經純化也難以避免由于交叉抗原引起的非特異反應. 同時由于HCMV培養(yǎng)周期長和病毒產量低等原因使HCMV純化困難較大. 我們克服了用感染的人胚肺二倍體細胞培養(yǎng)物制備全病毒抗原需嚴格的防護條件、產量有限、穩(wěn)定性欠佳、與其他皰疹病毒有交叉反應等不利因素.DNA重組技術的發(fā)展使得大量選擇性地制備病毒抗原或抗原性片段成為可能，研究表明,將一種或幾種重組蛋白作為抗原即可檢測HCMV陽性血清. Rolf等2用PCR方法擴增HCMV 8種不同開放讀碼框架的DNA片段，并表達了相應的重組蛋白，免疫印跡結果表明只有病毒蛋白的3種重組多肽對血清學診斷是必需的. PP15

17、0 的495691aa片段是確診HCMV既往感染的最適抗原（IgG結合表位）；而8621048aa片段（IgM結合表位）是急性感染的最佳血清學標志物之一. 國內周鐵群及王清等研究證實,HCMV主要結構蛋白PP150的羧基末端部分是HCMVIgM的重要結合表位，在檢測HCMV原發(fā)及急性期感染中起著極其重要的作用3，4.我們構建了含有HCMV特異性強抗原決定簇片段的重組抗原（8411084aa）,用Westernblot檢測了15份HCMV IgM陽性患者的血清，其中12份發(fā)生陽性反應，陽性識別率為80.0%. 目前國內檢測血清抗HCMVIgM主要采用間接ELISA法，但該法檢測所需時間長，操作步

18、驟繁瑣、易受類風濕因子等的影響，所以結果不穩(wěn)定. CGIDA與酶聯(lián)免疫分析法比較5具有多方面的優(yōu)點:不需要酶標檢測儀等儀器,更適合現(xiàn)場應用;實驗結果和膠體金試紙可長期保存;省去底物反應這一步,加快了檢測速度;膠體金標記蛋白質時金顆粒與蛋白分子之間的結合屬于物理吸附過程,所以整個標記過程對蛋白質的生物活性影響很小,且易獲得較高的標記率;膠體金不屬于生物活性物質,干擾檢測結果的因素將大大減少. 本研究比較了CGIDA與商品化ELISA試劑盒檢測結果,符合率為96.0%，敏感性為74.2%，特異性100%，研究結果表明重組抗原pp150用于CGIDA對HCMV的早期診斷，具較好的應用價值.【參考文獻

19、】1 呂貫廷，郭晏海，盧冰，等. 膠體金免疫斑點法檢測人巨細胞病毒pp150抗體J.臨床檢驗雜志，2002；20（6）：358-359.Lü GT, Guo YH, Lu B, et al. Detection of IgM antibodies to HCMV PP150 by Coloidal Gold Immunodotting AssyJ. Chin J Clin Lab Sci, 2002;20（6）:358-359.2 Rolf V, Vornhagen R, Plachter B, et al. Early serodiagnosis acute human cytomegalovirus infection by enzymelinked immunosorbent assay using recombinant antigensJ. J Clin Microbio,1994;32(4):981-986