1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握一種提取蛋白的方法。2、掌握一種檢測(cè)牛乳質(zhì)量的方法。2、 實(shí)驗(yàn)原理酪蛋白是乳蛋白質(zhì)中最豐富的一類蛋白質(zhì)，約占乳蛋白的8082%，酪蛋白不是單一的蛋白質(zhì)，是一類含磷的復(fù)合蛋白質(zhì)混合物，以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相結(jié)合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量約為35g/L ，比較穩(wěn)定，利用這一性質(zhì)，可以檢測(cè)牛乳中是否摻假。酪蛋白在其等電點(diǎn)時(shí)由于靜電荷為零，同種電荷間的排斥作用消失，溶解度很低，利用這一性質(zhì)，經(jīng)牛乳調(diào)到pH4.6 ，酪蛋白就從牛乳中分離出來(lái)。酪蛋白不溶于乙醇，這個(gè)性質(zhì)被利用來(lái)從酪蛋白粗制劑中將脂類雜質(zhì)除去。3、 儀器和試劑

2、儀器：溫度計(jì)、布氏漏斗、pH 試紙、抽濾瓶、電爐、燒杯、量筒、表面皿、天平等。試劑：1. 95% 乙醇、乙醚2. pH4.6 乙酸鈉緩沖液0.2mol/L3. 乙醇、乙醴混合液：乙醇：乙醴 =1 ： 1 （體積比）4. 市售牛乳4、 實(shí)驗(yàn)步驟1. 酪蛋白等電點(diǎn)沉淀將 100ml 牛乳放到500ml 燒杯中，加熱至40左右的乙酸鈉緩沖液，直到pH 達(dá) 4.6 左右，用pH試紙或酸度計(jì)調(diào)試。將上述懸浮液冷卻至室溫，然后放置5min,用細(xì)布過(guò)濾，收集沉淀。2. 除脂類雜質(zhì)將上述沉淀用少量水洗數(shù)次，然后懸浮于30ml95%的乙醇中。將此懸浮液傾于布氏漏斗中，抽濾除去乙醇溶液，再倒入乙醇乙醚混合液洗滌沉

3、淀兩次，最后再用一米洗滌沉淀兩次，抽干。將沉淀從布氏漏斗中移去，在表面皿上攤開以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白純品。準(zhǔn)確稱重后，計(jì)算出每100ml牛乳所制備出的酪蛋白數(shù)量（g% ,并與理i產(chǎn)量（3.5g%）相比較，求出實(shí)際獲得百分率。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康拿甘侵参矬w內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，植物體內(nèi)的生化反應(yīng)，一般都是在酶的作用下進(jìn)行的，沒(méi)有酶的催化反應(yīng)，植物的生命也就停止了，因此對(duì)酶的研究是闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)中十分重要的部分。為要研究酶首先要將酶從組織中提取出來(lái)，加以分離、純化， 不同的研究目的對(duì)酶制劑的純度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制劑即可，而有些工作則要求較純的酶制劑，需根據(jù)不同情況區(qū)別對(duì)待。

4、在酶的提取和純化過(guò)程中，自始至終都需要測(cè)定酶的活性，通過(guò)酶活性的測(cè)定以監(jiān)測(cè)酶的去向。二、實(shí)驗(yàn)原理（一）酶的提取1. 酶的存在位置?存在于動(dòng)植物以及微生物的細(xì)胞的各個(gè)部位。2. 如何將酶從細(xì)胞中分離?從高等植物中提取酶常遇到一些實(shí)際問(wèn)題，首先是細(xì)胞中含有許多種酶，每種酶的濃度又很低，只占細(xì)胞總蛋白質(zhì)中的極小部分（葉中的雙磷酸核酮糖羧化酶除外），而許多植物組織中蛋白質(zhì)的含量又很低。此外，各種酶的存在狀態(tài)不同，有在細(xì)胞外的外酶，在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)酶，內(nèi)酶中又有與細(xì)胞器一定結(jié)構(gòu)相結(jié)合的結(jié)合酶，也有的存在于細(xì)胞質(zhì)中，提取時(shí)都應(yīng)區(qū)別對(duì)待，作不同處理。如果酶僅存在于細(xì)胞質(zhì)中，只要將細(xì)胞破碎，酶就會(huì)轉(zhuǎn)移到提取液中；

5、但如果是與細(xì)胞器（如細(xì)胞壁、細(xì)胞核、線粒體、原生質(zhì)膜、微粒體等）緊密結(jié)合的酶，這時(shí)如僅僅破碎細(xì)胞還不夠， 還需要用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒚笍倪@些結(jié)構(gòu)上溶解下來(lái)。其次， 細(xì)胞中存在抑制物質(zhì)，如酚， 酸，離子等，它們通常在液泡中，當(dāng)細(xì)胞破碎時(shí)，這些物質(zhì)象蛋白質(zhì)一樣從細(xì)胞中釋放出來(lái)，進(jìn)入提 取液中，特別是酚類物質(zhì)，具有游離的酚羥基，能與蛋白質(zhì)肽鍵的氧原子形成強(qiáng)的氫鍵，不能為一般的實(shí)驗(yàn)方法，如透析和凝膠過(guò)濾所解離。酚易氧化產(chǎn)生醌，醌為一種強(qiáng)氧化劑，會(huì)使蛋白質(zhì)的功能團(tuán)發(fā)生氧化或發(fā)生聚合，使蛋白質(zhì)上的反應(yīng)基團(tuán)，如 -SH, -NH2,通過(guò)1, 4-加成反應(yīng)而 發(fā)生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物組織和提取液產(chǎn)生

6、棕色，以致影響酶活性的測(cè)定。因此如果沒(méi)有特殊需要，一般常選用植物的非綠色部分或者黃化的幼苗，在這些組織中一般酚類化合物含量較低。在提取過(guò)程中為了盡量減少酚類的影響，一般提取液常選用高pH 值的緩沖溶液，因?yàn)樵诟遬H 值時(shí)，酚類大部游離而不與蛋白質(zhì)形成強(qiáng)的氫鍵，但高 pH 值促進(jìn)酚類氧化，同時(shí)降低酚類吸附劑（如PVP）的有效性，通常采用 pH6.7棉7.2 o已經(jīng)知道 PVP能與游離酚羥基形成強(qiáng)的氫鍵復(fù)合物，是酚類化合物的有效結(jié)合劑。在提取線粒體時(shí)加入可溶性PVP,提取可溶性酶時(shí)加入不溶性交聯(lián)PVP （Polyvinyl polypyrrolidone ,簡(jiǎn)稱PVPP或PolyclarAT ）,

7、能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金屬元素及 PVP單體，可加10%HCl煮沸10分鐘，用NaOH中和，再用水洗幾次，直至中性，純化后的PVPP不必干燥就可直接應(yīng)用。植物細(xì)胞有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，需要強(qiáng)烈的方法去破碎，少量樣品可用研缽加石英砂研磨，或用玻璃勻漿器。大量樣品則需用電動(dòng)勻漿器。為減低研磨或勻漿過(guò)程中發(fā)熱，所用器皿和溶液需要預(yù)冷，提取液的用量一般為組織的1棉5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般寧可用量小些，將殘?jiān)偬崛∫淮巍Ｌ崛驖{時(shí)加入酚類結(jié)合劑PVPP金屬螯合劑 Na2-EDTA以及-SH 化合物以保護(hù)蛋白質(zhì)，或加入非離子型去垢劑如TritonXp-100 ， 以

8、增加蛋白質(zhì)的可溶度，常用于與膜脂結(jié)合的酶。總之，可以通過(guò)試驗(yàn)以確定提取蛋白質(zhì)的最佳條件。（二）分離和純化1. 酶的粗提液是否只有酶，有沒(méi)有其它物質(zhì)?上面制備得到的提取液中，除含有所需要的酶外，還含有其他蛋白質(zhì)，以及其他大分子和小分子化合物雜質(zhì)。 2. 如何將酶從粗提液只分離純化?要在許多蛋白質(zhì)的混合物中分離出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有鹽析法，往層析法，薄膜超濾法，親和層析法，電泳法等。在大體積的提取液中一般先采用硫酸銨分級(jí)鹽析沉淀。鹽析法是提純酶使用最早的方法之一，迄今仍廣泛使用，而且在高濃度的鹽溶液中酶蛋白不易變性而失去活性，利于工作在室溫中進(jìn)行。不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度有不

9、同程度的降低，鹽析法就是利用這一性質(zhì)，將不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)分離，選擇合適飽和度的硫酸銨，使沉淀的蛋白質(zhì)的酶活性最大。大多數(shù)酶的活性存在于35棉45麻口 45棉55%包和度硫酸鏤沉淀的部分，但也有存在于65棉80%包和度的（如花椰菜根的過(guò)氧化物酶）。沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)離心后收集之，再 溶于少量緩沖溶液中，經(jīng)透析或凝膠柱過(guò)濾，以除去硫酸銨及其他小分子雜質(zhì)，然后再經(jīng)過(guò)柱層析分離。由于吸附劑的不同，又有吸附柱層析、離子交換柱層析和凝膠過(guò)濾柱層析等。對(duì)于不同的支持物采用的洗脫方法也不同，分子篩類型凝膠過(guò)濾柱層析，洗脫液只要用一定濃度的緩沖液就可以了，亦即等濃度洗脫。對(duì)于吸附柱和離子交換柱層析，往往要采用濃度梯

10、度溶液進(jìn)行洗脫，最方便的是線性梯度濃度，當(dāng)然用非線性梯度會(huì)得到更好的分離效果。柱層析一般都需要自動(dòng)收集儀， 如果能配用蛋白質(zhì)檢測(cè)儀就更好了。目前柱層析和硫酸銨分級(jí)沉淀一樣，已經(jīng)成為一種常規(guī)的酶的分離提純的步驟之一了。近年來(lái)純化酶常用的一種有效方法為親和層析。主要利用酶和底物、抑制劑或輔酶具有一定的結(jié)合能力，這一性質(zhì)即可用來(lái)分離、提純酶。首先選擇一支持物，如瓊脂糖（Sepharose ）將底物、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或輔酶，以共價(jià)鍵的形式連接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流過(guò)裝有專一性底物、競(jìng)爭(zhēng)抑制劑或輔酶的層析柱，酶即被保留在支持物上，再經(jīng)過(guò)充分洗滌除去未被吸附的雜質(zhì)，然后用含有一定濃度的底物或競(jìng)爭(zhēng)性

11、抑制劑或輔酶的緩沖液，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性洗脫。如果親和劑選擇合適，往往能得到較高純度的酶，是酶分離、純化中既方便又最有效的一種方法。（三）酶活力的測(cè)定酶的活力表現(xiàn)為催化某一反應(yīng)的速度，反應(yīng)速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反應(yīng)速度可以用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的積累量來(lái)表示。由于酶的催化作用和周圍環(huán)境的關(guān)系十分密切，環(huán)境的溫度、pH、離子強(qiáng)度等都對(duì)酶的活力有很大的影響，因此測(cè)定酶活力時(shí)應(yīng)該使這些條件保持恒定。酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分鐘所分解的底物量（或生成的產(chǎn)物量）心mol數(shù)表示之。測(cè)定酶活性的方法很多，常因反應(yīng)的底物和產(chǎn)物的性質(zhì)不同可選用不同的方法，應(yīng)用最廣泛的是比色法或分光光度法。凡反

12、應(yīng)系統(tǒng)中的化合物在紫外區(qū)或可見(jiàn)光區(qū)有吸收峰的都可以用這種方法進(jìn)行測(cè)定。如果酶催化的是一需氧反應(yīng)，如氧化酶，則可用測(cè)壓法或氧電極法。如果催化的反應(yīng)系統(tǒng)中需要 ATP或產(chǎn)生ATP,如一些激酶；或是有NAM在，如一些脫氫酶和氧化還原酶；或者反應(yīng)產(chǎn)生HQ,如一些氧化酶，這些酶的活性可以用生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行測(cè)定。總之，測(cè)定酶活性的方法很多，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇合適的方法。三、材料、儀器與試劑要求用硫酸銨分級(jí)沉淀部分純化過(guò)氧化物酶。（一）、材料：花椰菜根（二）、儀器（儀器的選擇在實(shí)驗(yàn)開始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報(bào)告中提出方案后教師審定）冰凍離心機(jī)；751 型分光光度計(jì)；電磁攪拌器；組織搗碎機(jī)；天平；量筒；移液

13、管；燒杯；透析袋。（三）、試劑（試劑的選擇在實(shí)驗(yàn)開始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報(bào)告中提出方案后教師審定后并配制）PVPP;硫酸鏤；0.02mol/L KH 2PO溶液；0.lmol/L磷酸鉀緩沖液，PH6.0。四、實(shí)驗(yàn)操作（ 1 ） 酶的提取：取花椰菜根（或其他植物材料）用自來(lái)水洗凈，吸干水分，稱得鮮重，按每 g5ml提取溶液，加入預(yù)冷的0.02mol/LKH 2PO溶液，加入材料鮮重10%PVPP（預(yù)先經(jīng)過(guò)純化，用蒸播水吸脹）。在預(yù)冷的組織搗碎機(jī)中攪成勻漿。勻漿倒在燒杯中，于冰箱中浸提1 小時(shí)，用4 層紗布或尼龍布袋過(guò)濾，濾液于 18000r/min 冷凍離心15 分鐘， 棄去沉淀，上清液即為酶的粗提取

14、液。（ 2 ）硫酸銨分級(jí)沉淀：用量筒量得酶液的體積，吸取5ml 留作酶活性及蛋白質(zhì)含量分析，保存在冰箱中，其余酶液加入固體硫酸銨，使達(dá)35%飽和度（參閱附表8），加硫酸銨時(shí)要緩慢，以避免造成局部濃度過(guò)高，在電磁攪拌器上邊攪拌邊加入。然后置冰箱中半小時(shí)，離心如上。分別收集上清液和沉淀，上清液中再加入硫酸銨使達(dá)65%飽和度，再離心，收集沉淀和上清液。按這樣的方法分別收集 0棉35% 35棉65% 65棉80% 80棉100%包和度硫酸鏤沉淀。每部分沉淀分別復(fù)溶于1/20原始提取液體積的0.02mol/LKH 2PO溶液中，裝入透析袋中，用大量KH2PO溶液（2000ml）在冰箱中進(jìn)行透析過(guò)夜，其間更換KH2PO溶液約4次，直至無(wú)（SO） 2-析出為止（用BaCl 2溶液檢查）。透析完畢后，