1、陜西香菊藥業(yè)集團(tuán)有限公司GMP管理文件題 目紫外分光光度法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編 碼：XJWS/QC20403共7頁(yè)第1頁(yè)制 定審 核批 準(zhǔn)制定日期審核日期批準(zhǔn)日期頒發(fā)部門GMP辦頒發(fā)數(shù)量2份生效日期分發(fā)單位質(zhì)量技術(shù)部、綜合部版 本 號(hào)A/01. 目的：建立用紫外分光光度法檢測(cè)藥品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，保證標(biāo)準(zhǔn)操作。 2. 引用標(biāo)準(zhǔn)：中華人民共和國(guó)藥典（2015年版四部）通則。3. 范圍：本標(biāo)準(zhǔn)適用于用紫外分光光度法進(jìn)行的檢測(cè)。 4. 責(zé)任人： QC檢驗(yàn)員對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施負(fù)責(zé)，QC主管負(fù)責(zé)檢查監(jiān)督。5. 內(nèi)容：5.1定義：紫外分光光度法是通過(guò)被測(cè)物質(zhì)在紫外光區(qū)的特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)

2、該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法，本法在藥品檢驗(yàn)中主要用于藥品的鑒別、檢查和含量測(cè)定。 5.1.1. 定量分析通常選擇在物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)出吸收度，然后用對(duì)照品或百分吸收系數(shù)計(jì)算出被測(cè)物質(zhì)的含量，多用于制劑的含量測(cè)定。 5.1.2. 對(duì)已知物質(zhì)定性可用吸收峰波長(zhǎng)或吸光度比值作為鑒別方法；若化合物本身在紫外光區(qū)無(wú)吸收，而雜質(zhì)在紫外光區(qū)有相當(dāng)強(qiáng)度的吸收，或在雜質(zhì)的吸收峰處該化合物無(wú)吸收，則可用本法作雜質(zhì)檢查。5.2 原理：物質(zhì)對(duì)紫外輻射的吸收，是由于分子中原子的外層電子躍遷所產(chǎn)生的，因此，紫外吸收主要決定于分子的電子結(jié)構(gòu)，故紫外光譜又稱電子光譜。有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中如含有共軛體系、芳香環(huán)或發(fā)色基

3、團(tuán)，均可在近紫外區(qū)（200400nm）或可見(jiàn)光區(qū)（400760nm）產(chǎn)生吸收。通常使用的紫外分光光度計(jì)的工作波長(zhǎng)范圍為190900nm，因此又稱紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。紫外吸收光譜為物質(zhì)對(duì)紫外區(qū)輻射的能量吸收?qǐng)D。朗伯·比耳（lambert-Beer）定律為光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分析的依據(jù)，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為： A=lg1=ECLT題 目紫外分光光度法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼：XJWS/QC20403共7頁(yè) 第2頁(yè)式中：A 為吸光度 T 為透光率 E 為吸收系數(shù) C 為溶液濃度 L 為光路長(zhǎng)度若溶液的濃度（C）為1%（g/ml），光路長(zhǎng)度（L）為1cm，相應(yīng)的吸收系數(shù)為百分吸收系數(shù)

4、，以E表示。若溶液的濃度（C）為摩爾濃度（mol/L），光路長(zhǎng)度為1cm時(shí)，則相應(yīng)吸收系數(shù)為摩爾吸收系數(shù)，以來(lái)表示。5.3. 儀器： 5.3.1. 紫外分光光度計(jì)主要由光源、單色器、樣品室、檢測(cè)器、記錄儀、顯示系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。5.3.2. 為了滿足紫外可見(jiàn)光區(qū)全波長(zhǎng)范圍的測(cè)定，儀器備有二種光源，即氘燈和碘鎢燈，前者用于紫外區(qū)，后者用于可見(jiàn)光區(qū)。5.3.3. 單色器通常由進(jìn)光狹縫、出光狹縫、平行光裝置、色散元件、聚焦透鏡或反射鏡等組成，色散元件有棱鏡和光柵二種，棱鏡多用天然石英或熔融硅石制成，對(duì)200400nm波長(zhǎng)光的色散能力很強(qiáng)，對(duì)600nm以上波長(zhǎng)的光色散能力較差，棱鏡色散所得

5、的光譜為非勻排光譜。光柵系將反射或透射光經(jīng)衍射而達(dá)到色散作用，故常稱為衍射光柵，光柵光譜是按波長(zhǎng)作線性排列，故為勻排光譜，雙光束儀器多用光柵為色散元件。5.3.4. 檢測(cè)器有光電管和光電倍增管二種。5.3.5. 紫外分光光度計(jì)依據(jù)其結(jié)構(gòu)和測(cè)量操作方式的不同，可分為單光束和雙光束分光光度計(jì)二類。單光束分光光度計(jì)有些仍為手工操作，即固定在某一波長(zhǎng)，分別測(cè)量比較空白、樣品或參比的透光率或吸收度，操作比較費(fèi)時(shí)，用于繪制吸收光譜圖時(shí)很不方便，但適用于單波長(zhǎng)的含量測(cè)定。雙光束分光光度計(jì)藉扇形鏡交替切換光路，使光分成樣品（S）和參比（R）兩光束，并先后到達(dá)檢測(cè)器，檢測(cè)器信號(hào)經(jīng)調(diào)制分離成兩光路對(duì)應(yīng)信號(hào)，信號(hào)的

6、比值直接用記錄儀記錄，雙光束分光光度計(jì)操作簡(jiǎn)單，測(cè)量快速，自動(dòng)化程度高，但作含量測(cè)定時(shí)，為求準(zhǔn)確起見(jiàn)，仍宜用固定波長(zhǎng)測(cè)量方式。5.4. 紫外分光光度計(jì)的檢定：題 目紫外分光光度法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼：XJWS/QC20403共7頁(yè) 第3頁(yè)5.4.1.1. 波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的允差范圍：雙光束光柵型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)波長(zhǎng)準(zhǔn)確度允許誤差為±0.5nm。單光束棱鏡型350nm處±0.7nm，500nm處±2.0nm，700nm處±4.8nm。5.4.1.2. 波長(zhǎng)準(zhǔn)確度檢定方法： 5.4.1.2.1. 用低壓汞燈檢定，關(guān)閉光源，將汞燈（用筆式汞燈最方便）直接對(duì)準(zhǔn)進(jìn)光

7、狹縫，如為雙光束儀器，用單光束能量測(cè)定方式，采用波長(zhǎng)掃描方式，掃描速度“慢”（如15nm/min），響應(yīng)“快”，最小狹縫寬度（如0.1nm）量程0-100%，在200800nm范圍內(nèi)單方向重復(fù)掃描3次，由儀器識(shí)別記錄各峰值（若儀器無(wú)“峰檢測(cè)”功能，必要時(shí)可對(duì)指定波長(zhǎng)進(jìn)行“單峰”掃描）。單光束儀器以751G型為例，可將選擇開(kāi)關(guān)放在×0.1位置，透光率讀數(shù)放在100（或選擇開(kāi)關(guān)放在×1，透光率放在10），關(guān)小狹縫，打開(kāi)光閘門，緩緩轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)盤，尋找汞燈546.07nm峰出現(xiàn)的位置，若與波長(zhǎng)讀數(shù)不符，應(yīng)調(diào)節(jié)儀器左側(cè)準(zhǔn)直鏡的波長(zhǎng)調(diào)整螺絲。如波長(zhǎng)向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)，應(yīng)順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)波長(zhǎng)調(diào)

8、整螺絲，如向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)，則應(yīng)反時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)波長(zhǎng)調(diào)整螺絲，調(diào)整好后，再按汞燈的下列譜線測(cè)試，記錄每條譜線與儀器波長(zhǎng)讀數(shù)的誤差。用于檢定紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的汞燈譜線波長(zhǎng)：237.83、253.65、275.28、296.73、302.15、313.16、334.15、365.02、365.48、366.33 、404.66 （紫色）、435.83（藍(lán)色）、546.07（綠色）、 576.96（黃色）、579.07nm。5.4.1.2.2用儀器固有的氘燈檢定：本法主要用于日常工作中波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的核對(duì)，取單光束能量測(cè)定方式，測(cè)量條件同上述低壓汞燈的方法，對(duì)486.02及656.10nm二單峰進(jìn)行單

9、方向重復(fù)掃描3次。5.4.1.2.3用氧化鈥玻璃檢定：將氧化鈥玻璃放入樣品光路，參比光路為空氣，按測(cè)定吸收光譜圖方法測(cè)定。校正自動(dòng)記錄儀器時(shí)，應(yīng)考慮記錄儀的時(shí)間常數(shù)，測(cè)定樣品與校正時(shí)取同一掃描速度。氧化鈥玻璃在279.4、287.5、333.7、360.9、418.7、460.0、484.5、536.2、637.5nm波長(zhǎng)處有尖銳的吸收峰，可供波長(zhǎng)檢定用。氧化鈥玻璃因制造的原因，每片氧化鈥的吸收峰波長(zhǎng)有差異，應(yīng)使用經(jīng)計(jì)量部門校驗(yàn)過(guò)的。5.4.1.2.4用高氯酸鈥溶液檢定：本法可供沒(méi)有單光束測(cè)定功能的雙光束紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)準(zhǔn)確度檢定用。高氯酸鈥溶液的配制方法：取10%高氯酸為溶劑，加入氧化題

10、目紫外分光光度法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼：XJWS/QC20403共7頁(yè) 第4頁(yè)鈥（HO2O3），配成4%溶液即得。高氯酸鈥溶液較強(qiáng)的吸收峰波長(zhǎng)為241.13、278.10、287.18、333.44、345.47、361.31、416.28、451.30、485.29、536.64、640.52nm。 如果是雙光束掃描儀器，但不是數(shù)據(jù)貯存型的，記錄的波長(zhǎng)可能因記錄筆滯后而非真實(shí)波長(zhǎng)，為了準(zhǔn)確測(cè)定，建議采用定點(diǎn)檢定而不用掃描方式。 5.4.2. 吸光度準(zhǔn)確度：精密稱取在120干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約60mg，置1000ml量瓶中，用硫酸液（0.005mol/L）溶解并稀釋至1000ml，用配對(duì)的

11、1cm石英池，以硫酸液（0.005mol/L）為空白，在235、257、313、350nm分別測(cè)定吸光度，然后換算成E，測(cè)得值應(yīng)符合下表中規(guī)定的允差范圍（±1%）。 分光光度法允差范圍波長(zhǎng)（nm）吸收度強(qiáng)度吸收系數(shù)（E）允差范圍235257313350最小最大最小最大124.5144.048.6106.6123.0126.0142.8146.247.050.3105.5108.5 分辨率、雜散光、基線平直度、穩(wěn)定度、絕緣電阻等項(xiàng)檢定，按中華人民共和國(guó)國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程JJG682-90雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢定規(guī)程執(zhí)行，并符合有關(guān)項(xiàng)下的規(guī)定。日常常規(guī)測(cè)定主要是對(duì)以上兩項(xiàng)時(shí)常檢查。 5

12、.5. 樣品測(cè)定操作方法：5.5.1. 吸收系數(shù)測(cè)定（性狀項(xiàng)下）：按各該品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)吸收度，并計(jì)算吸收系數(shù)，應(yīng)符合規(guī)定范圍。5.5.2. 鑒別及檢查：按各該品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，測(cè)定供試品溶液在有關(guān)波長(zhǎng)處的最大及最小吸收，有的并須測(cè)定其各最大吸收峰值，或最大吸收與最小吸收的比值，均應(yīng)符合規(guī)定。 5.5.3. 含量測(cè)定：5.5.3.1. 對(duì)照品比較法：按各該品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，分別配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液中所含被測(cè)成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測(cè)成分規(guī)定量的（100±10）%以內(nèi)，用同一溶劑，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸光

13、度。題 目紫外分光光度法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼：XJWS/QC20403共7頁(yè) 第5頁(yè)5.5.3.2. 吸收系數(shù)法：按各該品種項(xiàng)下配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)及該波長(zhǎng)±1nm處測(cè)定其吸收度，按各該品種在規(guī)定條件下給出的吸收系數(shù)計(jì)算含量。采用吸收系數(shù)法，應(yīng)對(duì)儀器進(jìn)行校正后測(cè)定，如測(cè)定新品種的吸收系數(shù)，需按“吸收系數(shù)測(cè)定法”的規(guī)定進(jìn)行。5.5.3.3. 計(jì)算分光光度法：采用該法的品種，應(yīng)嚴(yán)格按該品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行，用本法時(shí)應(yīng)注意：有一些吸收度是在供試品或其成分吸收曲線的上升或下降陡坡部測(cè)定，影響精度的因素較多，故應(yīng)仔細(xì)操作，盡量使測(cè)定供試品和對(duì)照品的條件一致；若該品種不用對(duì)照品，則應(yīng)在

14、測(cè)定前對(duì)儀器作仔細(xì)的校正和檢定。5.6. 注意事項(xiàng)：5.6.1. 試驗(yàn)中所用的量瓶、移液管均應(yīng)經(jīng)檢定校正、洗凈后使用。5.6.2. 使用的石英吸收池必須潔凈。用于盛裝樣品、參比及空白溶液的吸收池，當(dāng)裝入同一溶劑時(shí)，在規(guī)定波長(zhǎng)處測(cè)定吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配對(duì)使用，否則必須加以校正。取吸收池時(shí)，手指拿毛玻璃面的兩側(cè)。裝盛樣品溶液，以池體積的4/5為度，測(cè)定揮發(fā)性溶液時(shí)應(yīng)加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應(yīng)無(wú)殘留溶劑，為防止溶劑揮發(fā)后溶質(zhì)殘留在池子的透光面，可先用醮有空白溶劑的擦鏡紙擦拭，然后再用干擦鏡紙拭凈。吸收池放入樣品室時(shí)應(yīng)注意每次放入方向相同。5.6.3使用

15、后用溶劑及水沖洗干凈，晾干防塵保存。吸收池如污染不易洗凈時(shí)，可用硫酸，發(fā)煙硝酸（3：1V/V）混合液稍加浸泡后，洗凈備用。如用鉻酸鉀清潔液清洗時(shí)，吸收池不宜在清潔液中長(zhǎng)時(shí)間浸泡，否則清潔液中的鉻酸鉀結(jié)晶會(huì)損壞吸收池的光學(xué)表面，并應(yīng)充分用水沖洗，以防鉻酸鉀吸附于吸收池表面。5.6.4. 測(cè)定前應(yīng)先檢查所用的溶劑在測(cè)定供試品所用的波長(zhǎng)附近是否符合要求，可用1cm石英吸收池盛溶劑，以空氣為空白，測(cè)定其吸收度，應(yīng)符合下表規(guī)定。以空氣為空白測(cè)定溶劑在不同波長(zhǎng)處的吸收度的規(guī)定 波長(zhǎng)范圍（nm） 220240 241250 251300 300以上 吸收度 <0.4 <0.2 <0.1 &

16、lt;0.05每次測(cè)定時(shí)應(yīng)采用同一廠牌批號(hào)，混合均勻的一批溶劑。題 目紫外分光光度法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼：XJWS/QC20403共7頁(yè) 第6頁(yè)5.6.5. 稱量應(yīng)按藥典規(guī)定要求。配制測(cè)定溶液時(shí)，稀釋轉(zhuǎn)移次數(shù)應(yīng)盡可能少；轉(zhuǎn)移稀釋時(shí)，所取容積一般應(yīng)不少于5ml。含量測(cè)定供試品應(yīng)取2份，如為對(duì)照品比較法，對(duì)照品一般也應(yīng)稱取2份。吸收系數(shù)檢查也應(yīng)稱取供試品2份，平行操作，每份結(jié)果對(duì)平均值的偏差應(yīng)在±0.5%以內(nèi)。作鑒別或檢查可取樣品1份。5.6.6. 供試品測(cè)試液的濃度，除各該品種項(xiàng)下已有注明外，供試品溶液的吸收度以在0.30.7之間為宜，吸收度在此范圍誤差較小，并應(yīng)結(jié)合所用儀器吸收度線性

17、范圍，配制合適的讀數(shù)濃度。5.6.7. 選用儀器的狹縫寬度應(yīng)小于供試品的吸收帶的半寬度，否則測(cè)得的吸收度會(huì)偏低，狹縫寬度的選擇應(yīng)以減小狹縫寬度時(shí)供試品的吸收度不再增加為準(zhǔn)，對(duì)于中國(guó)藥典紫外測(cè)定的大部分品種，可以使用2nm縫寬，但對(duì)某些品種如青霉素鉀及鈉的吸收度檢查則用1nm縫寬或更窄，否則其264nm的吸收度會(huì)偏低。5.6.8. 測(cè)定時(shí)除另有規(guī)定外，應(yīng)在規(guī)定的吸收峰±2nm處，再測(cè)幾點(diǎn)的吸收度，以核對(duì)供試品的吸收峰位置是否正確，并以吸收度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。除另有規(guī)定外吸收度最大波長(zhǎng)應(yīng)在該品種項(xiàng)下規(guī)定的波長(zhǎng)±1nm以內(nèi)，否則應(yīng)考慮試樣的同一性、純度以及儀器波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度。

18、5.7. 結(jié)果計(jì)算：5.7.1. 對(duì)照品比較法：可根據(jù)供試品溶液及對(duì)照品溶液的吸收度與對(duì)照品溶液的濃度以正比法算出供試品溶液的濃度，再計(jì)算含量。 A樣：A對(duì)=C樣：C對(duì) C樣=A樣/A對(duì)×C對(duì) 式中：A為吸收度值；C為測(cè)試液濃度（以mg/ml計(jì)）。 5.7.2. 吸收系數(shù)法：中國(guó)藥典規(guī)定的吸收系數(shù)，系指E，即在指定波長(zhǎng)時(shí)，光路長(zhǎng)度為1cm，試樣濃度換算為1%（g/ml）時(shí)的吸收度值，故應(yīng)先求出被測(cè)樣品的E值比較，可計(jì)算出供試樣品的含量。 A E（樣品）= C·L 式中：A為供試品溶液測(cè)得的吸收度值；題 目紫外分光光度法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼： XJWS/QC20403共7頁(yè) 第7頁(yè) C為供試品溶液的百分濃度，即100ml中所含溶質(zhì)的克數(shù)；L為吸收池的光路長(zhǎng)度（cm）； 供試品的含量%=E（樣品）×100%E（標(biāo)準(zhǔn)） 式中：E（樣品）為根據(jù)前式計(jì)算出的供試品的百分吸收系數(shù)； E（標(biāo)準(zhǔn)）為藥典或標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的百分吸收系數(shù)。 5.8. 吸收系數(shù)測(cè)定法：本法主要用于新品種的吸收系數(shù)測(cè)定。5.8.1. 測(cè)定方法