1、酵母菌的分離鑒定、固定化及酒精發酵吳英玲 10197020 10 生物創新班摘要： 酵母菌喜歡酸性環境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培養基富集培 養酵母菌，然后在 YPG培養基上用劃線法分離純化出酵母菌。將分 離的酵母菌轉接于 YPG斜面培養基上培養，待長好后置于冰箱內 4 下保存。用 TTC顯色劑及杜氏小管觀察法篩選出發酵能力高的 酵母菌。并通過菌落形態、細胞形態、生化分析及分子生物學手段 進行微生物鑒定。采用 PVA-海藻酸鈉固定化技術固定酵母細胞進行 酒精發酵。關鍵詞： 酵母菌 分離鑒定 固定化 酒精發酵Abstract: Yeast like acid environment, the use

2、 of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and

3、duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation 。前言酵母菌( yea

4、st )是一類單細胞真菌。一般呈圓形、卵圓形、 圓柱形，其菌落呈乳白色或紅色，表面濕潤、粘稠，易被挑起。酵 母菌多數為腐生，專性或兼性好氧，廣泛生長在偏酸性的潮濕的含 糖環境中，例如水果、蔬菜、蜜餞的內部和表面以及在果園土壤中 最為常見。酵母菌在有氧環境下將葡萄糖轉化為水和二氧化碳，主 要用于饅頭、面包等食品發酵；在工業上，釀酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae )將葡萄糖、果糖、甘露糖等單糖吸入細胞內，在無氧的條件下，經過體內酶的作用，把單糖分解為二 氧化碳和酒精。此作用即酒精發酵。C6H12O6（葡萄糖） 2 C2H5OH（酒精）+2 CO2在釀酒酵母酒精發酵的生產

5、和應用中，由于細胞破碎和酶純化 等操作往往導致酶活性和穩定性都受影響，從而降低產酒精效率。 而利用細胞固定化可以很好的解決這一問題。微生物細胞固定化方 法主要有三種：載體結合法，交聯法和包埋法，其中固定包埋法是 目前比較理想的方法。包埋法就是將微生物細胞均勻地包埋在多孔 的水不溶性的緊密結構中，細胞中的酶處于活化狀態，因而活性 高，活力耐久。目前，利用聚乙烯醇（ PVA）海藻酸鹽是包埋法中 比較高效的一種，這種方法以 PVA-海藻酸鈉作為混合溶膠，將酵母 細胞固定起來進行酒精發酵，不僅可以使細胞濃度增加，而且可以 多次使用，減少了酵母培養增殖所消耗的糖分；操作簡單、過程迅 速、顆粒不粘連、顆粒

6、強度大大提高，且增加了顆粒的生物活性和 穩定性，因此可實現連續化生產，提高酒精生產效率。1. 材料與方法1.1 材料1.1.1 材料與試劑成熟葡萄皮、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、豆芽、去離子水、 PVA 、海藻酸鈉、 CaCl2、紅糖、異丙醇、乙醇、液氮、 Taq酶、 dNTPs、引物、酵母膏，葡萄糖， （NH4） 2SO4，K2HPO4?3H2O， MgSO4?7H2O、H2SO4 ，1% K2Cr2O7 ，10% NaOH等1.1.2 培養基乳酸豆芽葡萄糖培養液：豆芽（ 60 g ）、葡萄糖（ 6 g）, pH 值4.5 。YPG培養基（ 500 ml ）：酵母膏（ 5 g ）、蛋白胨（

7、 10 g）、葡萄 糖（10 g ）、瓊脂（ 10 g ）、pH值6.5 6.8TTC 上層培養基： TTC 0.05 g 、葡萄糖 0.5 g 、瓊脂 1.5 g 、水l00 ml 。酒精發酵培養液：紅糖 100 g， (NH4) 2SO4 2.0 g ，KH2PO4 1.0 g ， pH自然，去離子水定容至 1000 ml。1.1.3 實驗器材酒精計、試管、杜氏小管、移液槍、滴管、顯微鏡、三角瓶、 烘箱、燒杯、 PCR儀，電泳儀、接種環、電磁爐、報紙、橡皮筋 等、玻璃棒、三角瓶、培養皿、試管、吸管、移液槍、漏斗、紗 布、瓷缸、刮鏟、載玻片、酒精燈、高壓蒸汽滅菌鍋、載玻片、蓋 玻片1.2 實

8、驗方法1.2.1 酵母菌的分離與培養取葡萄皮于 90 ml 無菌水，放置于搖床 150 rpm，搖晃 5 min ，取 出后稍靜置。用無菌槍頭吸取上清液 1 ml接入9 ml的乳酸豆芽葡萄 糖培養液中，置 2830烘箱中培養 48小時。富集后用碘液染色后 鏡檢。然后用接種環在事先滅菌的 YPG固體劃線并置于 2830 再 培養48 h ，得到酵母初篩單菌落，觀察菌落，用碘液簡單染色鏡 檢。1.2.2 發酵菌株的篩選向劃線分離的 YPG培養基上倒入 TTC上層培養基， 30 下保溫 (陰暗處)2 3 h 。比較各菌株間的顏色深淺，顏色深的菌株呼吸酶 活力強，有較強的產酒精能力。選取平板中對應的顏

9、色較深的 10株 菌，作為二級篩的出發菌株。選取上述顯色較深的酵母菌落，挑取一接種環接入乳酸豆芽葡 萄糖培養液中，同時試管內倒置一杜氏小管，培養 24 h 后，觀察杜 氏管中產氣情況。打開棉塞，嗅聞是否有酒精氣味。記錄產氣及酒 精氣味情況，并與顯色情況進行比較。1.2.3 發酵菌株的鑒定進行形態學鑒定： A菌落形態觀察，按普通微生物實驗指導書 觀察所分離的真菌菌落特征。 B. 細胞形態學觀察，按普通微生物實 驗指導書簡單制片法觀察，先低倍鏡，后高倍鏡觀察。分子生物學鑒定：主要對核糖體小亞基 16SrRNA進行 PCR擴增鑒 定，挑取形態學觀察符合酵母特征的菌落作為擴增模版進行 PCR， PCR

10、體系 (25ul) 為：表一 PCR 反應體系ddH2O34.610×PCR buffer ( withoutlMgCl2)5 lMgCl2 (25 mM)4 ldNTP(10 mM)1 l5'primer(10 mM)2 l3'primer(10 mM)2 lTemplate ( 50 -500 ng/l )1 lTaq DNA polymerase(5U/ l)0.4 lTotal50 l94預變性 5 min個循環94變性30 sec52退火30 sec 4072延伸60 sec72延伸5 min4保溫(到達此溫度時停止 PCR擴增，將 PCR管取出)將符合要求

11、的樣品，按公司測序訂單要求填寫。測序結果登陸 NCBI網站，進行在線比對分析。1.2.4 釀酒酵母細胞 PVA-海藻酸鈉固定化技術菌種活化：挑取酵母菌斜面菌種一環，接 1環斜面菌苔于裝有 20mL培養基的 150mL三角瓶中活化，置于恒溫搖床內， 150r/min 培養 24 h，25 培養 30 h 。再將其用 0.85%生理鹽水制成菌懸液，酵母 數控制在 108個/ml 。固定化：聚乙烯醇 PVA-海藻酸鈉混合膠于無菌燒杯中加熱融 化，冷卻至 45 左右。酵母菌液（預熱至 35 左右）與聚乙烯醇 PVA-海藻酸鈉按 1: 4 比例（ v/v ）混合均勻后，制備固定化細胞。 用注射頭直徑為

12、2 ml 注射器以恒定速度滴到 250 ml 三角中，瓶中 預先盛有 50 ml 的含 2 % CaCl2溶液使形成凝膠珠。然后取 60 粒凝 膠珠加入 150 ml 無菌葡萄糖培養液中，置 25 下發酵 4d，測定其 酒精含量。2. 結果與分析2.1 發酵菌株初篩結果將葡萄皮中的酵母菌進行富集培養后酵母菌生長迅速，在液體 培養基中比霉菌生長得快。不同組材料來源不同，結果顯示葡萄皮 中的酵母菌數量較多。故而在酒精發酵中，酵母菌選擇的來源非常 重要。在 YPG培養基上用劃線法分離純化出酵母菌， 48h 后觀察菌 落。圖一菌落呈乳白色，表面濕潤、粘稠，易被挑起。圖二為高倍 鏡下觀察到的酵母菌，箭頭

13、處明顯觀察到酵母菌的出芽生殖方式， 幾乎呈鏈狀。圖三為平板劃線后分離單菌落。圖 發酵菌株初篩結果2.2 TTC 法篩選酵母及酵母產氣情況TTC（2，3，5 一氯化苯基四氮哇 ）是一種顯色劑，它對酵母的 代謝產物發生呈色反應，通過它可以判斷酵母中呼吸酶活力的大 小，在 YPG培養基上覆蓋 TTC上層培養基培養后出現深紅色菌落， 說明該菌株產酒精能力較強。酵母進行酒精發酵過程會產生CO2，根據杜氏小管中產氣多少可以間接判斷酵母發酵能力的強弱。再進一 步挑取紅色較深的菌落進行產氣檢驗發現杜氏小關中氣體較多，進 一步說明所篩選的菌株具有較強的發酵能力，可以進行后續操作。 圖四 TTC法篩選正面圖，圖五

14、為 TTC法篩選反面，圖六產氣檢驗結 果。由第四管看出， CO2仍在不斷產生氣體，故而在后續操作中用此 管中的酵母菌進行操作。圖 TTC 法篩選酵母及酵母產氣情況表二 酵母菌落顯色深淺與杜氏小管中產氣多少之間的關系管號顏色產氣量1號粉紅+2號紅+3號粉紅+4號深紅+2.3 分子生物學鑒定挑取發酵能力較強的菌落進行菌落 PCR，電泳結果如圖七，條 帶約為 450bp，可以進行測序。測序結果登陸 NCBI網站，進行在線 比對分析。該序列與編碼 Irpex lacteus isolate T2b(Han,G.,Feng,X. and Tian,X )的 18S rRNA基因的部分序列有 57%的相似

15、 度。圖八和圖九為序列比對結果。 ( 此處僅展示分子生物學鑒定方法 )圖 菌落 PCR結果圖 序列比對結果2.4 釀酒酵母細胞 PVA-海藻酸鈉固定化打開固定化細胞發酵的三角瓶，與未加凝膠珠的瓶子對比，嗅 聞有酒香氣，上層溶液有渾濁，凝膠珠形狀是完好無損。與其他組 實驗結果進行比較，從而選出酒精濃度最高一組，進行旋轉蒸發獲 得高濃度酒精。3. 討論與反思 （1）本實驗采用平板分離酵母菌時，培養時間不應該過長，因為長 時間培養增加了染霉菌的可能性（圖三），并且若需得到純度較高 的酵母菌則需進一步進行平板劃線分離酵母菌菌株。因此控制霉菌 生長很重要，可采取多步平板劃線的方式克服此難關。（2）富集培

16、養后需對溶液中酵母進行死活統計，從而初步判斷此次 富集的酵母菌的生存能力是否滿足工業酵母生存能力。死活統計的 方法有 0.l% 美藍染色液染色法，活酵母菌可使美藍還原，從而使菌 體不著色。（ 3）表一中總結出 TTC染色后，菌落顏色深淺和產氣量的關系，顏 色越深，產氣量越多，故在后期酒精發酵時應挑取菌落顏色深的， 提高酒精產量。（4）微生物鑒定時需要采取不同的方法進行生物學鑒定，形態學鑒 定時有可能出現雜菌，導致觀察失誤。分子學鑒定也可能產生假陽 性，故在鑒定時不同方法之間要相互驗證，使結果更具有說服力。（5）固定化培養酵母進行酒精發酵時，凝膠珠中細胞濃度增加，而 且可以多次使用，減少了酵母培養增殖所消耗的糖分；操作簡單、 過程迅速、顆粒不粘連、顆粒強度大大提高，且增加了顆粒的生物 活性和穩定性，因此可實現連續化生產，提高酒精生產效率。但在 凝膠珠中，代謝物的積累可能影響酵母的生長繁殖和產酒精量，本 人推測這可能與凝膠珠的大小有關系，故針對此處設計實驗。實驗設計：1. PVA-海藻酸鈉融化 45，加