1、貝類毒素的測定第30頁，共30頁。一、麻痹性貝類毒素（PSP） Para1ytical shellfish poisoning nPSP中毒是最常見的食用貝類中毒nPSP由一組石房蛤毒及其衍生物組成，PSP與渦鞭毛藻的水華有關(guān)（106個細(xì)胞升）nPSP在世界范圍內(nèi)分布 nPSP中毒引起神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，呼吸困難，感覺窒息，心肺衰竭而在224小時內(nèi)死亡n一般PSP中毒在0.5-2h的時間內(nèi)，癥狀逐漸發(fā)展，能承受12h以上的中毒者一般能康復(fù) 第30頁，共30頁。麻痹性貝類毒素的測定方法n國際上麻痹性貝類毒素的檢測方法較多，主要有小白鼠法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、放射性免疫法等。n生物法(即小白鼠法

2、)是國際慣用的麻痹性貝類毒素的測定方法，已被美國公職分析化學(xué)家協(xié)會公定分析方法（AOAO）收入，而成為最普遍應(yīng)用的檢驗方法。n生物法(即小白鼠法)，系采用ICR系列的小白鼠作為檢驗動物，進(jìn)行貝類毒素分析n生物法(即小白鼠法)優(yōu)勢：當(dāng)使用生物法檢測法時，一旦發(fā)現(xiàn)超標(biāo)樣品，則本批樣品不得食用，這說明所檢測貝類中相關(guān)的毒素含量已經(jīng)影響到人們的食用安全，不適合食用。第30頁，共30頁。麻痹性貝類毒素的測定生物法 (SC/T 3023-2003)原理n根據(jù)小鼠注射貝類提取液后的死亡時間，查出鼠單位，計算確定每100g貝肉中PSP的含量n特點：測定結(jié)果代表存在于貝肉內(nèi)各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的麻痹性貝類毒素的總量n鼠

3、單位 mouse unit，MU：對體重為20g的小白鼠腹腔注射1mL麻痹性貝類毒素后，小鼠在15min時死亡所需的最低毒素量 第30頁，共30頁。第30頁，共30頁。第30頁，共30頁。第30頁，共30頁。樣品的測定檢樣的制備n貝類 洗凈外殼，切斷閉殼肌，開殼，用清水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來雜質(zhì)，仔細(xì)取貝肉，收集瀝水5min（避免貝肉堆積），撿出碎殼等雜物，將貝肉均質(zhì) n注意：取肉時切勿割破肉體，開殼前不能加熱或用麻醉劑第30頁，共30頁。樣品的測定檢樣的制備n貝類罐頭1.將罐內(nèi)所有內(nèi)容物（包括貝肉組織及汁液），于均質(zhì)器中均質(zhì)2.大容量的罐頭，則過濾分離貝肉及汁液，分別稱重，將固形物和湯汁

4、按比例混合，充分均質(zhì)n冷凍貝類 在室溫下，使冷凍的樣品（帶殼或脫殼的）呈半冷凍狀態(tài)，按上述規(guī)定的方法清洗、開殼、淋洗、取肉、均質(zhì)第30頁，共30頁。樣品的測定提取n取 1 0 0 g 樣 品 于 8 0 0 m L 燒 杯 中 ， 加0.1mol/L HCl溶液100mL充分?jǐn)嚢?，檢查pH（pH應(yīng)為2.0-4.0）。需要時，可逐滴加入5mol/L HCl溶液或0.1mol/L NaOH溶液調(diào)整pH，加堿時速度要慢，同時需不斷攪拌，防止局部堿化破壞毒素n將混合物加熱，并徐徐煮沸5min，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至2.0-4.0（切勿4.5）。將混合物移至量筒中并稀釋至200mL第30頁，共30頁。樣

5、品的測定提取n將混合物倒回?zé)?，攪拌至均質(zhì)狀，使其沉降至上清液呈半透明狀，不能堵塞注射針頭即可n必要時將混合物或上清液以3000r/min離心5min，或用濾紙過濾n保留進(jìn)行小鼠注射用的足量液體（約10mL）第30頁，共30頁。樣品的測定小鼠試驗n選擇ICR系小鼠n稱重：以感量為0.1g的天平將小鼠稱重并記錄重量第30頁，共30頁。樣品的測定小鼠試驗n每個樣品注射3只小鼠，每只小鼠腹腔注射1mL提取液。注射時若有一滴以上提取液溢出，須將該只小鼠丟棄，并重新注射一只小鼠n記錄注射完畢時間，仔細(xì)觀察 并用秒表記錄小鼠停止呼吸時 的死亡時間（到小鼠呼出最 后一口氣止）第30頁，共30頁。樣品的測定小

6、鼠試驗n若注射樣品原液后，1只或2只小鼠的死亡時間大于7min，則需再注射至少3只小鼠以確定樣品的毒力n若小鼠的死亡時間小于5min，則要稀釋樣品提取液后，再注射另一組小鼠（3只），得到5min-7min的死亡時間n稀釋提取液時，要調(diào)節(jié)pH至2.0-4.0,逐滴加入0.1mol/L或0.01mol/LHCl溶液第30頁，共30頁。結(jié)果的計算與判斷n根據(jù)小鼠的死亡時間，在附錄B 中查出相應(yīng)的每毫升注射液的鼠單位數(shù)Mn 將存活鼠的死亡時間視為大于60min即相當(dāng)于0.875MUn若試驗動物重量19g或21g。則根據(jù)附錄C查出重量校正系數(shù)kn樣品中PSP的含量按公式（1）計算。（1） 式中： X樣品

7、中PSP含量，每百克樣品中鼠單位（MU / 100g） Ki每只小鼠的重量校正系數(shù) Mi每只小鼠的鼠單位數(shù)，鼠單位（MU） D樣品提取液的稀釋倍數(shù) 200樣品量，克（g）第30頁，共30頁。第30頁，共30頁。第30頁，共30頁。結(jié)果的計算與判斷毒力單位轉(zhuǎn)換樣品中的毒力單位的按公式（4）計算。F80g /100g400MU/100g （3） F=5式中： F毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)； 80g /100g樣品中PSP限量，g /100g 400MU/100g樣品中PSP限量，MU/100g第30頁，共30頁。二、腹瀉性貝類毒素（DSP）Diarrhetic shellfish poisoningnDSP是由

8、于雙殼貝類濾食含毒的渦鞭毛藻而引起n影響較嚴(yán)重的地區(qū)主要是日本和歐洲沿海國家，發(fā)病率高，引起許多國家地區(qū)的關(guān)注n受DSP中毒的癥狀表現(xiàn)為消化功能紊亂（腹瀉、嘔吐、腹痛），食用含毒貝類后30分鐘至幾小時出現(xiàn)癥狀，中毒者一般在3-4天康復(fù)，尚無死亡病例第30頁，共30頁。腹瀉性貝類毒素的測定方法n在國際上對腹瀉性貝類毒素的檢測方法較多，主要有生物法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、放射性免疫法等n生物法（小白鼠法，Mouse bioassay）是最常用的一種方法第30頁，共30頁。 腹瀉性貝類毒素的測定 生物法(SC/T 3024-2004)原理n用丙酮提取貝類中毒素，再轉(zhuǎn)移至乙醚中，經(jīng)減壓濃縮蒸干后

9、，再以1%吐溫60生理鹽水溶解殘留物，注射小白鼠觀察存活情況，計算其毒力試劑和材料n丙酮（分析純）n乙醚（分析純）n1%吐溫-60生理鹽水：稱取1.0g吐溫-60，溶于生理鹽水（0.8%NaCl）中，并定容至100.0mL第30頁，共30頁。儀器和設(shè)備n旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器n均質(zhì)器n磨口燒瓶：圓底，500 mL，250 mL，100 mLn布氏漏斗：100mmn分液漏斗：具塞，500 mLn天平：感量0.1gn刻度試管：10mL，具塞n冰箱：0-5和-15- -20n注射器：1mLn注射器針頭：8#n小白鼠：體重為16-20g的健康ICR系雄性小白鼠 第30頁，共30頁。檢樣的制備生鮮帶殼的貝類n用清水

10、徹底洗凈貝類外殼，開殼，用清水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來雜質(zhì)，仔細(xì)取出貝肉，切勿割破肉體n收集貝肉，瀝水5min，撿出碎殼等雜物，迅速冷凍，貯藏備用n注意不要破壞閉殼肌以外的組織，尤其是中腸腺（又稱消化盲囊，組織呈暗綠色或褐綠色）。開殼前不能加熱或用麻醉劑冷凍貝類n在室溫下，使冷凍的樣品（帶殼或去殼的）呈半冷凍狀態(tài)，按上述方法清洗、開殼、淋洗、取肉第30頁，共30頁。檢樣的制備n可以切取中腸腺的貝類（扇貝、貽貝、牡蠣等），稱取200g貝肉后，仔細(xì)切取全部中腸腺，將中腸腺稱重后細(xì)切混合做為檢樣，注意不要使中腸內(nèi)容物污染案板n 對于尚未確定部位毒性的貝類及不易切取中腸腺的小型貝肉，可將全部貝肉細(xì)切

11、、混合，做為檢樣n為避免毒素的危害，應(yīng)戴手套進(jìn)行檢驗操作，移液管等用過的器材應(yīng)在5%的次氯酸鈉溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解；廢棄的提取液等也應(yīng)用5%的次氯酸鈉溶液處理第30頁，共30頁。提取n取處理好的中腸腺，或200g貝肉置于均質(zhì)杯內(nèi)，均質(zhì)2minn加3倍量丙酮，與樣品充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，用布氏漏斗抽濾并收集提取液。對殘渣以檢樣兩倍量丙酮再次抽濾兩次，合并抽濾液第30頁，共30頁。提取n將抽提液移入500mL的磨口燒瓶中，減壓濃縮（旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，56）去除丙酮，直至在液體表面分離出油狀物n將濃縮液移入分液漏斗內(nèi)，以100mL200mL乙醚和少量的水洗下粘壁部分，輕輕振蕩(不能生成乳濁液)，靜置

12、分層后，去除水層(下層)n用相當(dāng)乙醚半量的蒸餾水洗乙醚層兩次，再將乙醚層移入250mL的磨口燒瓶中，減壓濃縮(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，35)去除乙醚第30頁，共30頁。提取n以少量乙醚將濃縮物移入100mL磨口燒瓶中，再次減壓濃縮去除乙醚n以1%吐溫60生理鹽水將全部濃縮物在刻度試管中稀釋到10mL。此時1mL試液相當(dāng)于20g去殼貝肉的重量，以此懸浮液做為試驗原液第30頁，共30頁。小白鼠試驗n振蕩使試液或其稀釋液成為均勻的懸浮液n將每只小白鼠稱重，每三只小白鼠為一組，分別將1mL試液注射到小白鼠腹腔中n同時，另取三只小白鼠作為對照組，注射1mL 1%吐溫-60生理鹽水于腹腔中n觀察自注射開始到24h后的小白鼠 存活情況，求出一組三只中死亡兩 只及兩只以上的最小注射量n小白鼠注射腹瀉性貝毒后的癥狀 為運(yùn)動不活潑，大多呼吸異常， 致死時間長第30頁，共30頁。結(jié)果計算和表述n使體重16-20g的小白鼠在24h死亡的毒力為1個小白鼠單位（MU）n樣品中DSP毒力的計算，按表1選擇24h內(nèi)死亡二只及二只以上白鼠的最小注射量及最大稀釋倍數(shù)進(jìn)行計算第30頁，共30頁。注射量與毒力