1、3500基因測序儀操作流程一、啟動儀器1按下儀器的電源鍵，當儀器指示燈為綠色時表明儀器正常開啟。2打開與儀器連接的計算機，點擊Ctrl+Alt+Delete界面，點擊Administrator，輸入密碼：Administrator。等待Daemon（隱藏圖標），Server Monitor程序完全啟動，Server Monitor圖標上出現綠色對號時表示連接成功。3打開3500 Data Collection 軟件，出現 3500 Log In 登錄界面，輸入用戶名和密碼，本機用戶名為：Administrator，密碼為：Administrator1，點擊“OK”，打開軟件。檢查所有耗材的剩余

2、用量、儀器的信息、耗材的使用信息以及儀器維護提示燈信息。4. 確認檢測陰性、陽極緩沖液在刻度線以上，以及確認所有耗材已恢復至室溫。注：3500測序所用到的陽極緩沖液、陰極緩沖液在儀器上可存放一周，POP膠在儀器上存放一周后需置于2-8保存，洗液為一次性消耗品，不可重復使用。5. 將陰性緩沖液、陽極緩沖液、洗液等耗材安裝至儀器上后，點擊refresh，確認所有耗材均為有效狀態。二、儀器維護1. 于軟件主界面點擊Dashbord，于菜單欄中選擇Maintenance Wizards選項。2. 將裝有陽極緩沖液的耗材從儀器中取下，安裝沒有陽極緩沖液的容器，選擇WASH pumper chamber

3、and chanels選項，按照儀器指示，開始清洗管路并重新給毛細管灌膠直至完成全部操作。3. 從Maintenance進入Spatial界面，按圖示指示進行空間定位。結果應滿足如下要求：峰高大致相同（大于6000）；峰型尖銳，左右堆成；橙色十字在峰頂端；峰間距為13-16。當結果滿足要求時，選擇“Accept Results”，否則，選擇“Reject Results”，重新進行空間定位。4. 從Maintenance進入Spectral界面，按圖示指示進行光譜校準。本儀器為8道毛細管，光譜校準品加樣的位置為A1-H1，校準結果允許借用周邊1道毛細管的結果；光譜校準通過顯示綠色，借用信息為黃

4、色箭頭，失敗為紅色。校準成功選擇“Accept”，否則，選擇“Reject”，重新進行光譜校準。三、檢測運行1. 測序PCR（以BigDye Terminator v3.1試劑盒為例），標準質粒和樣品推薦測序反應體系及反應條件如下：標準質粒測序反應體系：引物4 L，Big dye 1 L，BigDye Seq Buffer 3.5L，超純水10.5 L，模板1 L。樣品測序反應體系：引物（10 M）0.5 L，Big dye 1 L，BigDye Seq Buffer 3.5L，超純水14 L，模板1 L。測序反應條件為：96 1 min (96 10 sec 50 5 sec 60 4 mi

5、n)×25個循環 4 保溫2. 測序產物純化（以CENTRI-SEP spin-columns純化柱為例介紹） 于純化柱中加入800 L的無RNase超純水，顛倒混勻，室溫靜置30 min。 上下顛倒除盡氣泡，去掉純化柱底部的蓋子，置于2 mL洗脫管中，在將純化柱上部的蓋子打開后，蓋上蓋子，壓入空氣，柱中的液體自動流入洗脫管中直至自行終止，最后洗脫管中的液體大約為200-250 L，棄掉濾液。 750×g離心2 min去除多余液體，離心完畢后洗脫管中約有300 L液體。 將純化柱轉移至1.5 mL的樣品收集管中，從柱的斜面上緩緩加入20 L的PCR測序產物。 750

6、5;g離心2 min，取濾液備用，靜止重復離心。 3. 測序產物加樣 于待檢測孔中加入10 L的Hi-Di甲酰胺后，再次加入10 L純化后測序產物，混勻，盡量避免氣泡產生，不加樣的空中加入10 L的超純水。 于96孔板上安裝膠墊，按照順序組裝到自動進樣器上。4. 數據收集軟件運行點擊Start pre-heat預熱30 min，POP7和POP4的膠預熱到60 ，POP6的膠預熱到50 ，預熱后檢查detection cell的溫度。通過Main workflow鍵進入Set up視窗，選擇Define Plate Properties界面建立新的樣品反應板，在Name欄輸入樣品板的名稱，板子

7、類型：96孔板，毛細管長度：50 cm，膠以及測序類型根據需要選定。輸入樣本名稱，選擇相應的 Assays，File Name Conventions，Results Groups。切換到Load Plates for Run視圖，從Recent Plates找到要電泳的反應板，點擊Link Plate（灰色表示反應板連接上，黑色則表示沒有連接上），點擊Start Run進行電泳。切換到 Monitor Run 視圖，通過 Assay，Sample，EPT界面查看樣品的電泳情況；通過 Flags Found 界面借助軟件可直接判斷樣品的結果是否滿足質量要求，紅色旗幟表示不滿足質量要求，綠色旗幟

8、表示滿足質量要求。 進入Review Results視窗，點擊View Fragment/HID Results 查看樣品的電泳結果。如 Offscale（峰過高，導致滲透峰產生），Board Peak（寬峰）等要素的圖標為綠色方塊 ，Sizing Quality（內標的質量）為帶對號的綠色方塊，則表示滿足質量要求；如Offscale，Board Peak 的圖標為黃色三角形，Sizing Quality為帶X的紅色方塊，則表示不滿足質量要求，可以通過Plot View和Sizing Table View 等界面分別查看樣品的電泳圖譜和內標的情況。5. 測序結果分析 點擊sequence an

9、alysis V5.4軟件，輸入用戶名DangDongCIQ，輸入密碼123456，打開軟件。點擊File，選擇Add sample，選擇所需分析測序文件。點擊綠色三角形圖標進行測序結果分析。測序峰圖的熒光信號強度正常范圍為1000-3000，且峰間距明顯，測序結果質量分數較高，可視為本次測序基本成功。6. 常見問題及解決措施（1）信號值太高樣品濃度過高，應稀釋樣本濃度，降低進樣時間。反應體系中DNA加入過量。（2）無信號值 測序反應失敗。毛細管堵塞，重新灌膠。毛細管陣列彎曲，應重新更換毛細管陣列。毛細管破裂或損壞（3）低信號值甲酰胺降解，更換新的Hi-Di甲酰胺。樣本量不足，增加DNA的量。樣本中鹽濃度過高，采用蒸餾水或去離子水對樣本進行稀釋或采用去鹽的純化柱繼續樣本純化。測序樣本未充分混勻。DNA擴增效率低，重新擴增DNA或檢查DNA質量。自動進樣器超出校準范圍。檢查樣本體積，如果信號任然很低，聯系ABI技術顧問。（4）過高的基線管路中的膠可能存在污染，可采用conditional reagent清洗膠泵。膠中可能存在污