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文檔簡介

1、3500基因測序儀操作流程一、啟動儀器1按下儀器的電源鍵,當儀器指示燈為綠色時表明儀器正常開啟。2打開與儀器連接的計算機,點擊Ctrl+Alt+Delete界面,點擊Administrator,輸入密碼:Administrator。等待Daemon(隱藏圖標),Server Monitor程序完全啟動,Server Monitor圖標上出現綠色對號時表示連接成功。3打開3500 Data Collection 軟件,出現 3500 Log In 登錄界面,輸入用戶名和密碼,本機用戶名為:Administrator,密碼為:Administrator1,點擊“OK”,打開軟件。檢查所有耗材的剩余

2、用量、儀器的信息、耗材的使用信息以及儀器維護提示燈信息。4. 確認檢測陰性、陽極緩沖液在刻度線以上,以及確認所有耗材已恢復至室溫。注:3500測序所用到的陽極緩沖液、陰極緩沖液在儀器上可存放一周,POP膠在儀器上存放一周后需置于2-8保存,洗液為一次性消耗品,不可重復使用。5. 將陰性緩沖液、陽極緩沖液、洗液等耗材安裝至儀器上后,點擊refresh,確認所有耗材均為有效狀態(tài)。二、儀器維護1. 于軟件主界面點擊Dashbord,于菜單欄中選擇Maintenance Wizards選項。2. 將裝有陽極緩沖液的耗材從儀器中取下,安裝沒有陽極緩沖液的容器,選擇WASH pumper chamber

3、and chanels選項,按照儀器指示,開始清洗管路并重新給毛細管灌膠直至完成全部操作。3. 從Maintenance進入Spatial界面,按圖示指示進行空間定位。結果應滿足如下要求:峰高大致相同(大于6000);峰型尖銳,左右堆成;橙色十字在峰頂端;峰間距為13-16。當結果滿足要求時,選擇“Accept Results”,否則,選擇“Reject Results”,重新進行空間定位。4. 從Maintenance進入Spectral界面,按圖示指示進行光譜校準。本儀器為8道毛細管,光譜校準品加樣的位置為A1-H1,校準結果允許借用周邊1道毛細管的結果;光譜校準通過顯示綠色,借用信息為黃

4、色箭頭,失敗為紅色。校準成功選擇“Accept”,否則,選擇“Reject”,重新進行光譜校準。三、檢測運行1. 測序PCR(以BigDye Terminator v3.1試劑盒為例),標準質粒和樣品推薦測序反應體系及反應條件如下:標準質粒測序反應體系:引物4 L,Big dye 1 L,BigDye Seq Buffer 3.5L,超純水10.5 L,模板1 L。樣品測序反應體系:引物(10 M)0.5 L,Big dye 1 L,BigDye Seq Buffer 3.5L,超純水14 L,模板1 L。測序反應條件為:96 1 min (96 10 sec 50 5 sec 60 4 mi

5、n)×25個循環(huán) 4 保溫2. 測序產物純化(以CENTRI-SEP spin-columns純化柱為例介紹) 于純化柱中加入800 L的無RNase超純水,顛倒混勻,室溫靜置30 min。 上下顛倒除盡氣泡,去掉純化柱底部的蓋子,置于2 mL洗脫管中,在將純化柱上部的蓋子打開后,蓋上蓋子,壓入空氣,柱中的液體自動流入洗脫管中直至自行終止,最后洗脫管中的液體大約為200-250 L,棄掉濾液。 750×g離心2 min去除多余液體,離心完畢后洗脫管中約有300 L液體。 將純化柱轉移至1.5 mL的樣品收集管中,從柱的斜面上緩緩加入20 L的PCR測序產物。 750

6、5;g離心2 min,取濾液備用,靜止重復離心。 3. 測序產物加樣 于待檢測孔中加入10 L的Hi-Di甲酰胺后,再次加入10 L純化后測序產物,混勻,盡量避免氣泡產生,不加樣的空中加入10 L的超純水。 于96孔板上安裝膠墊,按照順序組裝到自動進樣器上。4. 數據收集軟件運行點擊Start pre-heat預熱30 min,POP7和POP4的膠預熱到60 ,POP6的膠預熱到50 ,預熱后檢查detection cell的溫度。通過Main workflow鍵進入Set up視窗,選擇Define Plate Properties界面建立新的樣品反應板,在Name欄輸入樣品板的名稱,板子

7、類型:96孔板,毛細管長度:50 cm,膠以及測序類型根據需要選定。輸入樣本名稱,選擇相應的 Assays,File Name Conventions,Results Groups。切換到Load Plates for Run視圖,從Recent Plates找到要電泳的反應板,點擊Link Plate(灰色表示反應板連接上,黑色則表示沒有連接上),點擊Start Run進行電泳。切換到 Monitor Run 視圖,通過 Assay,Sample,EPT界面查看樣品的電泳情況;通過 Flags Found 界面借助軟件可直接判斷樣品的結果是否滿足質量要求,紅色旗幟表示不滿足質量要求,綠色旗幟

8、表示滿足質量要求。 進入Review Results視窗,點擊View Fragment/HID Results 查看樣品的電泳結果。如 Offscale(峰過高,導致滲透峰產生),Board Peak(寬峰)等要素的圖標為綠色方塊 ,Sizing Quality(內標的質量)為帶對號的綠色方塊,則表示滿足質量要求;如Offscale,Board Peak 的圖標為黃色三角形,Sizing Quality為帶X的紅色方塊,則表示不滿足質量要求,可以通過Plot View和Sizing Table View 等界面分別查看樣品的電泳圖譜和內標的情況。5. 測序結果分析 點擊sequence an

9、alysis V5.4軟件,輸入用戶名DangDongCIQ,輸入密碼123456,打開軟件。點擊File,選擇Add sample,選擇所需分析測序文件。點擊綠色三角形圖標進行測序結果分析。測序峰圖的熒光信號強度正常范圍為1000-3000,且峰間距明顯,測序結果質量分數較高,可視為本次測序基本成功。6. 常見問題及解決措施(1)信號值太高樣品濃度過高,應稀釋樣本濃度,降低進樣時間。反應體系中DNA加入過量。(2)無信號值 測序反應失敗。毛細管堵塞,重新灌膠。毛細管陣列彎曲,應重新更換毛細管陣列。毛細管破裂或損壞(3)低信號值甲酰胺降解,更換新的Hi-Di甲酰胺。樣本量不足,增加DNA的量。樣本中鹽濃度過高,采用蒸餾水或去離子水對樣本進行稀釋或采用去鹽的純化柱繼續(xù)樣本純化。測序樣本未充分混勻。DNA擴增效率低,重新擴增DNA或檢查DNA質量。自動進樣器超出校準范圍。檢查樣本體積,如果信號任然很低,聯系ABI技術顧問。(4)過高的基線管路中的膠可能存在污染,可采用conditional reagent清洗膠泵。膠中可能存在污

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