1、第五章 酶與細胞的固定化技術教學目的：使學生了解并掌握固定化酶（細胞、原生質體）的概念及意義，掌握酶的常用固定化技術，了解固定化酶的性質。教學重點、難點：固定化酶（細胞、原生質體）的范疇，各種固定化技術。固定化酶（細胞、原生質體）的范疇,半透膜包埋法。教學方法：講授教學手段：多媒體第一節 概述一、游離酶使用中的局限性: 1.提取純化繁瑣,價格昂貴 2.難以重復使用 3.穩定性差二、固定化酶研究克服游離酶缺點的方法之一50年代開始60年代后期，固定化技術迅速發展1969年，千田一郎首次在工業生產規模應用固定化氨基酰化酶從DL-AA連續生產L-AA實現酶應用史上的一大變革三、基本概念1、固定化酶（

2、1971第一次國際酶工程學術會議）（Immobilized Enzyme) 指在一定空間范圍內呈閉鎖狀態存在的酶，能連續地進行反應，反應后的酶可以回收重復利用。包括酶與不溶性載體結合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝膠或超濾裝置中的酶。2、固定化細胞（原生質體） 指被限制自由移動的細胞，即細胞受到物理化學等因素約束或限制在一定空間范圍內，但細胞仍保留催化活性并具有能被反復或連續使用的活力。四、固定化酶優點增加了酶的穩定性能降低酶的總體費用酶的分離和回收變得容易，并可重復使用使反應過程的連續操作成為可能反應產物也易于提取純化有利于過程設計和優化拓廣了酶的應用范圍（多酶系統的酶反應，非水相酶反應

3、，生物傳感器探頭等） 第二節、酶的固定化方法一、酶的固定化方法1、酶的固定化方法（四大類方法） 1）吸附法 2）包埋法 3）交聯法 4）化學共價法 其它（酶的逆膠束包囊法）一、酶的固定化方法2、選擇方法依據： 酶的性質 載體的來源、價格、機械性能、載體的功能基團和交聯度等 制備方法簡便易行 衡量依據： 測定固定化酶的活力，以確定固定化過程的活力回收率； 研究它的最適反應條件（底物濃度、pH 值、溫度、離子強度等）； 穩定性和不穩定原因的探究； 對酶進行人工修飾，使其與載體的結合達到較為理想的構型和相容性。（一）吸附法1、原理：主要是利用細胞與載體之間的吸引力（范德華力、離子鍵和氫鍵），使細胞固

4、定在載體上，常用的吸附劑有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纖維等。     此外還可利用專一的親和力來固定細胞，例如伴刀豆球蛋白與一甘露聚糖具有親和力，而釀酒酵母細胞壁上含有一甘露聚糖，故可將伴刀豆球蛋白先連接到載體上，然后把酵母連接到活化了的伴刀豆球蛋白上。2、酶材料：酶或結合在菌體（死細胞）及細胞碎片上的酶或酶系。 3、優缺點：操作簡便，條件溫和，不會引起酶的變性失活，載體廉價易得，且可反復利用；缺點是蛋白質與載體之間的結合相當弱,而且很多情況下,酶的非特異性吸附常常會引起部分或全部失活,高濃度的鹽溶液或底物溶液又將加速蛋白質的脫附.因此當要求酶的

5、固定絕對牢靠時,采用吸附法是很不可靠的.4、常用吸附劑 各種礦物質以及無機載體(氧化鋁，氧化鐵，氧化鈦，硅藻土，多空陶瓷，多空玻璃，羥基磷灰石等)，及天然高分子載體淀粉、白蛋白等，最常用的吸附劑是離子交換劑羧甲基纖維素，DEAE-纖維素、DEAE-葡萄糖，合成的陰離子和陽離子交換劑離子交換劑主要靠靜電吸引，缺點是當離子強度增加或介質的pH、溫度變化時，這種結合發生分解。5、舉例：將伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含 0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）與酶液(10mg/ml) 5ml,在4，攪勻過夜，便成瓊脂糖復合物，用10mM

6、NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗滌，直至測不出活性為度，最后再懸浮于10ml NaAc PBS中備用。（二） 包埋法1、概念：指將酶或含酶菌體包埋在各種多空載體中，使酶固定的方法。 可分為凝膠包埋法（網格型）和半透膜包埋法（微囊型）兩種。2、優缺點：一般不需酶的AA殘基進行結合反應，很少改變酶的高級結構，酶活回收率高；缺點是包埋時發生化學聚合反應，酶易失活，須巧妙設計反應條件。另外網格結構影響底物和產物的擴散，有時，這種擴散會導致酶動力學行為的改變，所以此法只適合于小分子底物和產物的酶。3、 海藻酸鹽包埋法 海藻酸鈉與Ca2+,Mg2+,Al3+等多價離子間的轉

7、移凝膠作用,形成固定化細胞顆粒缺點: 在高濃度電介質（K+,Na+）溶液中,固定化顆粒變得不穩定. Ca2+等多價離子在磷酸緩沖溶液中易形成沉淀,固定化顆粒溶解優點: 海藻酸鹽價格便宜 包埋條件溫和4、角叉菜糖包埋法 K-角叉菜是一種含有許多硫酸根基團的多糖化合物.在K+離子存在下，它能立即生成凝膠.缺點: 對高濃度的Na+離子敏感 固定化溫度高,需要在3755 5、聚丙烯酰胺凝膠 在含酶(或細胞)的水溶液中，加入一定比例的單體丙烯酰胺和膠聯劑N,N-甲撐雙丙烯酰胺.然后在催化劑(二甲氨基丙腈)和引發劑(過硫酸鉀)的作用下低溫(冰浴)聚合,形成凝膠缺點: 丙烯酰胺對酶具有變性作用6、聚乙烯醇（

8、PVA）包埋法 磷酸鹽硬化法,循環冷凍法,硼酸硬化法硼酸硬化法: 將聚乙烯醇在70 80進行水浴加熱至完全溶解,然后冷卻至35,與酶溶液(細胞懸浮液)混勻,滴加到飽和硼酸溶液中優點: 原材料價格便宜 條件溫和 無毒害作用 循環冷凍法 硼酸硬化法7、半透膜包埋法7.1 界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有機相的界面上溶解度極低而形成被膜將酶包埋。操作：酶液在油溶性表面活性劑存在下在水不互溶的有機相中乳化形成油包水的微滴，再將溶于有機溶劑的高聚物加入乳化液中，然后加入一種不溶解高聚物的有機溶劑，使高聚物在油-水界面上沉淀析出，形成膜將酶包埋，最后在乳化劑幫助下由有機相移入水相。7、半透膜包埋法7.

9、2界面聚合法 利用親水性單體和疏水性單體在界面發生聚合的原理包埋酶。例: 將含10%血紅蛋白的酶液與1，6己二胺的水溶液混合，立即在含1%司盤-85的氯仿-環己烷中分散乳化，再加入溶于有機相的葵二酰氯后，便在油-水界面上發生聚合反應，形成尼龍膜，將酶包埋。（三） 交聯法 基本原理：酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵得到三向的交聯網架結構，以戊二醛使用最廣泛OHC（CH2）3CHO，使載體的氨基和酶蛋白中的氨基交聯形成席夫堿（基）Shiff 堿將酶固定化。含氨基的載體，可用氯乙基纖維素（纖維素-OCH2CH2NH2），二乙氨乙基纖維素（DEAE-纖維素）。雙功能試劑除了戊二醛外，還有乙撐二異氰酸酯

10、OCN（CH2）6NCO。交聯劑的特點：帶有二個以上的功能基團。反應比較劇烈條件比較嚴格。操作方便，活力回收不高。固定化分兩步進行，第一步形成可溶性分子間交聯絡合物，第二步是快速反應導致固化。交聯法有5種形式：酶直接交聯法在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液pH 和離子強度、溫度和反應時間之間的平衡。此法操作簡單，一種多功能試劑可制備許多酶衍生物，但缺乏選擇性，難于避免分子內交聯，活力回收往往不高。酶輔助蛋白交聯：為避免分子內交聯和在交聯過程中因化學修飾而引起失活，可使用第二個“載體”蛋白質（即輔助蛋白質，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來增加蛋白質濃度

11、，使酶與惰性蛋白質共交聯。實用中，當酶蛋白、無酶活性蛋白與戊二醛混合（戊二醛最終濃度0.7%）后，混合液粘度開始提高時，立即鋪膜，或者在酶蛋白戊二醛與輔助蛋白混合后，經-30低溫處理，再預熱至4而得泡沫狀蛋白質共聚物。這種固定化酶為多孔性，活力回收比酶直接交聯高，機械性能也有改進。吸附交聯法：先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯。用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。此法用于胞外酶的固定化較好，尤其是從發酵液和粗酶制劑中直接固定化時，載體的選擇性吸附有一定純化作用，而酶分子之間的共價交聯又保證酶分子緊緊地結合于載體上，而且酶分子僅

12、存在于載體表面，使固定化酶與底物接觸良好。由于載體本身有較好機械性能，所以產生的固定化酶裝柱流動性能好，缺點是必須保證酶吸附在載體上。載體交聯法：用多功能試劑的一部分功能基團化學修飾高聚物載體，而其中另一部分功能基團偶連酶蛋白。也可利用多功能試劑的一部分功能基團與一種聚合物的單體反應，反應后再與酶一起共聚。交聯包埋法：把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結成顆粒很細的集合體，然后用高分子或多糖一類物質進行包埋成顆粒。這樣避免顆粒太細的缺點，同時制得的固定化酶穩定性好戊二醛交聯法缺點： 雙功能基團試劑與酶蛋白的交聯作用，常引起蛋白質高級結構的改變，使酶失活。 為了避免或減少酶在交聯過程中失活，可在被交

13、聯的酶蛋白溶液中添加一定量的輔助蛋白。（四） 化學共價法1、概念所謂共價法就是使酶蛋白的非必需基團（-NH2,-OH,-COOH,-SH,酚基，咪唑基，吲哚基）通過共價鍵和不溶性載體形成不可逆的聯接。要使載體與酶形成共價鍵，必需首先使載體活化，接上一活潑基團，再與酶反應2、用于共價法固定的酶蛋白上的功能基團: 1）氨基-賴氨酸上的-氨基以及多肽鏈N末端氨基酸上的- 氨基; 2）羧基-雙羧基氨基酸:門冬氨基酸和谷氨酸上的游離羧基,以及多肽鏈末端的- 羧基; 3）酪氨酸上的苯酚環; 4）半胱氨酸上的巰基; 5）羥基-絲氨酸,蘇氨酸以及酪氨酸上的羥基 6）組氨酸上的咪唑基; 7）色氨酸上的吲哚基其中

14、以氨基和羧基為最常用3、一般認為共價法的特點如下： 酶和載體的結合比較牢固，酶不易脫落。故使用的半衰期較長。 制備條件復雜，反應劇烈，易引起酶蛋白高級結構發生變化。 制備得到的固定化酶，活力回收一般在50%左右。 載體不會引起蛋白質的變性，經得起一定的pH，濃度的改變。4、常用載體 天然高分子。如纖維素，葡聚糖凝膠（Sephadex），瓊脂糖（Agarose Sepharose），卡那膠，淀粉以及它們的衍生物。（利用-OH） 人工合成的高聚物，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，氨基酸共聚物等。（利用-NH2） 無機載體，如多孔玻璃，硅膠等。（要加上一個基團）5、 技術要點 將所選用的載體上的有

15、關基團活化，然后和酶蛋白上有關基團發生偶聯反應。（直接活化或另接一反應基團） 在選用的載體上接上一個雙功能試劑，然后將酶蛋白和雙功能試劑偶聯。（接手臂）6、分類：重氮法； 疊氮法； 縮合法； 烷化反應法； 硅烷化反應法；溴化氰法。 重氮法目前在我們國內用的較多的載體是對氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等，用這些載體制備了不少固定化酶。方法原理如下： 用雙功能試劑 - 硫酸酯乙砜基苯胺（SESA），連接于被活化（-OH）的纖維素等載體上制備成ABSE-纖維素，瓊脂糖等。 在鹽酸和亞硝酸鈉處理下把ABSE-纖維素變成重氮鹽。 把酶偶聯于ABSE-纖維素上 疊氮法是在酶分子

16、與載體間形成肽鍵的固定化方法。主要是含羧基載體，轉變成酰基疊氮氯化物，異氰酸鹽等活化形態的衍生物，然后與酶的游離氨基反應，從而形成肽鍵。例：用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶，步驟如下： 酯化：CM-纖維素依次用水、乙醇、乙醚洗滌干燥，然后懸于無水甲醇中，在冰浴中通入HCl 氣體，進行酯化反應；最后用甲醇、乙醚洗滌，空氣干燥。 肼解:把酯化后的CM-纖維素懸于甲醇中，再加入80%水合肼回流反應1 小時，過濾，甲醇洗滌干燥。 疊氮化:肼解后的CM-纖維素（1g）加入150ml 2% HCl 在冰浴中混合，攪拌滴加9ml 3% NaNO2 反應20min，過濾用冷蒸餾水洗滌，同時加酶，防止

17、戊二醛的另一醛再與載體上另一個-NH2 反應。(4) 偶聯：經疊氮化后的載體加入0.05N pH 8.0 磷酸緩沖液（內含250-500mg 酶），5攪拌2-3 小時，過濾用 0.001N HCl，水洗滌，即為固定化胰蛋白酶（凍干保存） 縮合法（對含-NH2,-COOH 載體的另一種方法）主要利用具有羧基或氨基的載體，加入到酶液中，在縮合劑碳化二亞胺（雙環己基碳酰胺）作用下，使載體的羧基或氨基和酶蛋白上的NH2 或 COOH 形成肽鏈而被固定。含羧基的載體有羧甲基纖維素，羧甲基交聯葡聚糖等。含氨基的載體有氨乙基纖維素，多孔玻璃氨基硅烷衍生物。 烷基化反應法。將含有鹵素官能團試劑與非水溶性的纖維

18、素載體進行烷化反應，然后和酶進行偶聯制得固定化酶。一般常用三氯三嗪基試劑活化纖維素，然后偶聯酶（交聯葡聚糖，瓊脂糖，多孔玻璃等）。 硅烷化法：多孔玻璃特點：機械強度好，表面積大。耐有機溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長等。一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。這些多孔玻璃的孔徑在2501000 埃之間，含SiO2 96%，由于粒度很細，每1 克所擁有的表面積達100 平方米（氧化鈉，氧化硼，氧化硅經熱處理原子重組而成，是優良載體，但必須加以改造）。本法進行酶的固定化可分三個步驟： 將本體接上一個結合劑（也即硅烷化）； 接上功能基團； 把酶共價結合于載體。 溴化氰法-異脲鍵合法本方法主要用溴化

19、氰（CNBr）活化多糖類物質。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數（大孔網狀結構）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。上述這些載體在高pH 條件下（pH11 左右），溴化氰和多糖一類物質形成一種環化的活潑的亞氨碳酸鹽，該化合物對蛋白質上的NH2 反應十分敏感，生成N-取代異脲，N-取代亞氨碳酸酯和N-取代氨基甲酸酯。其中主要產物為N-取代異脲，反應式如右：例：胰蛋白酶的固定-均在4時進行。 活化：稱取瓊脂糖凝膠100mg（Sepharose 4B），用0.5M NaCl 和H2O 洗滌，除去保護劑和防腐劑，然后按1ml 沉淀

20、凝膠加入50300mgCNBr。立即用2N NaOH 調pH 值1011，維持pH 值11，pH 值不再下降，直到反應終止。反應在25通風櫥內進行，反應僅需10 分鐘，這樣CNBr 將載體全部活化，生成活潑的亞氨碳酸鹽。反應完畢后，用冰水和冷0.1MpH9.5 NaHCO3 洗滌（注意：切忌用帶有-NH2 基的緩沖液來洗滌，因為亞氨碳酸鹽對NH2-敏感，在酶偶聯時，活性部位被NH2 占領，酶偶聯不上），去除多余CNBr 和雜蛋白。 偶聯：用偶聯緩沖液（0.025M pH 10.2 硼酸緩沖液-0.02M CaCl2 或NaHCO3 平衡洗滌，抽干，加入5ml 緩沖液（內含16mg 酶）溫度降至

21、4，攪拌反應4 小時，最后分別用0.1M pH8.5 硼酸緩沖液-1M NaCl 洗滌即成10.2M pH 4.0 醋酸緩沖液去除各種雜質第三節 細胞的固定化方法一、 吸附法同酶的方法，（1）酵母細胞帶負電荷，在pH3-5的條件下能吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等載體表面，制成固定化細胞（2）霉菌的菌絲可吸附在多孔塑料、金屬絲網等載體上來固定化（3）植物細胞可吸附在中空纖維外壁上固定化（4）動物細胞大多具有附壁生長特性，須依附在固體表面才能生長，可吸附在容器壁，微載體（顆粒細小的載體，直徑100-200um）和中空纖維外壁等載體上來固定（培養液在中空纖維內流動）。二、包埋法同酶包埋法例：海藻酸鈣-聚

22、賴氨酸（ALG-PLL）包埋技術 動物細胞先用海藻酸鈣凝膠包埋聚賴氨酸處理，使膠粒外層包上一層聚賴氨酸薄膜檸檬酸鈉溶液處理，使海藻酸鈣凝膠溶解聚賴氨酸膜包被的近乎透明的微囊型固定化 動物細胞。三、 原生質體固定化可解決胞內酶的生產利于氧的傳遞，營養成分的吸收一般采用凝膠包埋法包括原生質體的制備和固定兩個步驟1 原生質體的制備要求：保持膜的完整性，不能使細胞內部的結構遭到破壞制備：對數期細胞的收集高滲溶液中加酶破壁分離除去細胞碎片、完整的細胞及酶（密度梯度離心）原生質體2 原生質體的固定原生質體等滲緩沖液中配成一定濃度的原生質體懸浮液凝膠包埋角叉菜膠固定化 含滲透壓穩定劑的緩沖液與角叉菜加熱溶解

23、配成3%-8%的凝膠滅菌冷卻到50左右與等體積的原生質體懸浮液混合均勻滴入到一定濃度的預冷的氯化鉀溶液中球狀的固定化原生質體2 原生質體的固定光交聯樹脂固定化法用含有滲透壓穩定劑的緩沖液配制30%-60%濃度的光交聯樹脂預聚體，加熱溶解后，在50左右，加入1%光敏劑，與等體積的原生質體懸浮液混合均勻，攤成薄層，經紫外光照射2-3mm，聚合后切成一定形狀的小塊，制成片狀的固定化原生質體。第四節 固定化酶的評價 一、相對酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶與游離酶活力的比值稱為相對酶活力,它與載體的體結構、顆粒大小、底物分子量大小及酶的結合效率有關。相對酶活力低于75%的固定化酶,一般沒有

24、實際應用價值。 二、酶的活力固定化的單位定義為：轉化底物的量/固定化酶的單位重量（單位面積）/單位時間,單位是：mol/mg(cm2)/min。將酶進行固定化時,總有一部分酶沒有與載體結合在一起,測定酶的活力回收率可以確定固定化的效果。活力回收=固定化酶總活力/被固定化游離酶總活力×100%，或稱偶聯效率、活力保留百分數。一般情況下,活力回收率應小于1,若大于1,可能由于固定化活細胞增殖或某些抑制因素排除的結果。 三、固定化酶的半衰期 即固定化酶的活力下降為初始活力一半所經歷的時間。它是衡量固定化酶操作穩定性的關鍵，其測定方法與化工催化劑半衰期的測定方法相似,也可

25、以通過長期實際操作,也可以通過較短時間的操作來推算。 第五節 固定化酶的性質一、酶活力的變化 固定化酶的活力在多數情況下比天然酶的活力低，專一性也可能發生變化，其原因可能是：酶的構象的改變導致了酶與底物結合能力或催化底物轉化能力的改變；載體的存在給酶的活性部位或調節部位造成某種空間障礙，影響酶與底物或其他效應物的作用；底物和酶的作用受其擴散速率的限制。在個別情況下，固定化酶由于抗抑能力的提高使得它反而比游離酶活力高。 二、酶穩定性提高酶穩定性包括熱穩定性、對各種有機試劑的穩定性、對pH的穩定性、對蛋白水解酶的抗性及儲存穩定性等。三、最適pH值的變化 酶固定化后，催化底物的最適pH值和

26、pH活性曲線常發生變化，引起變化的因素主要有兩個1、載體帶電性質：載體帶負電荷時，會吸引反應液中的H+，致使酶附近反映區域pH比周圍反應液低，須提高反應液pH；反之，降低反應液pH。第五節 固定化酶的性質2、產物性質：由于載體的擴散障礙，產物為酸性時，產物積累在固定化酶所處的催化區域內，使此區域的pH降低，須提高須提高周圍反應液pH；反之，降低周圍反應液pH。四、最適溫度的變化 一般情況下，固定化后的酶的最適作用溫度與游離酶差別不大，但有時由于固定化方法和載體的影響，固定化酶的最適作用溫度 可能降低，也可能升高，須加以注意，最適溫度提高是有利的，可以降低酶的失活速率。五、 動力學常數

27、的變化(隨載體性質變化)：由于分配效應：=Si微環境/S宏觀環境對簡單的固定化酶系統，其動力學性質一般服從米氏方程： 載體與底物帶相同電荷，Si<S,則<1,Km>Km 固定化酶降低了酶的親和力。 載體與底物電荷相反，靜電作用，Si>S，>1,Km<Km六、底物特異性：對于作用于小分子底物的酶，變化不明顯；但對于可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶來說，由于載體空間位阻作用，大分子底物難以接近酶分子而使催化速度大大降低，如固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶，對二肽或多肽作用保持不變，對酪蛋白的作用僅為游離酶的3% 左右。第六節 固定化輔酶一、 輔酶固定化的意義輔酶類物質是一些“全酶”的組成成分，參與催化反應。同時當其與某些高分子物質結合時，可以大大提高催化效率。因