1、基因工程的基本操作程序（1 1）目的基因的獲取）目的基因的獲取（2 2）基因表達載體的構建）基因表達載體的構建（3 3）將目的基因導入受體細胞）將目的基因導入受體細胞（4 4）目的基因的檢測與鑒定）目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作程序主要包括四個步驟：基因工程基本操作程序主要包括四個步驟： 提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNA用適當的用適當的 限制酶切限制酶切 一定大小的一定大小的DNA片段片段將將DNADNA片段與載體連接片段與載體連接導入受體菌中儲存導入受體菌中儲存基因組文庫基因組文庫基因組文庫的構建方法：基因組文庫的構建方法：cDNA文庫的構建方法文庫的構建方法-反轉錄法反轉錄

2、法某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNA合成互補合成互補DNA形成雙鏈形成雙鏈DNA（即（即cDNA）導入受體菌中儲存導入受體菌中儲存與載體連接與載體連接cDNA文庫文庫 逆轉錄酶逆轉錄酶 （反轉錄酶）（反轉錄酶）DNA聚合酶聚合酶 原核細胞的基因結構原核細胞的基因結構非編碼區非編碼區非編碼區非編碼區編碼區編碼區編碼區上游編碼區上游 編碼區下游編碼區下游 啟動子啟動子終止子終止子編碼區編碼區: : 能能編碼蛋白質的序列編碼蛋白質的序列非編碼區非編碼區: : 不能能編碼蛋白質的序列不能能編碼蛋白質的序列（含基因（含基因表達的表達的調控序列調控序列）知識補充：知識補充：真核細胞的基因結構真核細胞的基

3、因結構能夠能夠編碼蛋白質的序列編碼蛋白質的序列叫做外顯子叫做外顯子 不能編碼蛋白質的序列不能編碼蛋白質的序列叫做內含子叫做內含子內含子內含子： 外顯子：外顯子： 真核真核細胞細胞的的 基因基因結構結構編碼區編碼區非編碼區非編碼區外顯子外顯子：能：能編碼蛋白質的序列編碼蛋白質的序列內含子內含子：不能編碼蛋白質的序列：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用的核苷酸序列，：有調控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區上游的包括位于編碼區上游的RNARNA 聚合酶結合位點（啟動子）。聚合酶結合位點（啟動子）。非編碼序列：非編碼序列：包括包括非編碼區非編碼區和和內含子內含子基因組文庫和基因組文庫和cDNA文庫比較

4、：文庫比較：（3）從基因文庫中得到目的基因的方法：）從基因文庫中得到目的基因的方法：依據：目的基因的有關信息。依據：目的基因的有關信息。如：根據基因的如：根據基因的核苷酸序列核苷酸序列 基因的基因的功能功能 基因基因在染色體上的位置在染色體上的位置 基因的基因的轉錄產物轉錄產物mRNA 基因基因翻譯產物蛋白質翻譯產物蛋白質等特性等特性2、利用利用PCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因（1）PCR技術：技術：是一項在生物是一項在生物體外體外復制特定復制特定DNA片段片段的核酸合的核酸合成技術，成技術，短時間內大量擴增目的基因短時間內大量擴增目的基因。（2）原理：原理：DNA雙鏈復制雙鏈復制（3）

5、條件：條件：DNA模板模板 引物（一對）引物（一對） 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸 Taq酶（耐高溫的酶（耐高溫的DNA聚合酶）聚合酶）緩沖液緩沖液（4）過程：過程：變性、退火、延伸變性、退火、延伸三步曲三步曲 變性：變性： 雙鏈雙鏈DNA單鏈單鏈DNA55 60 退火退火：90 95引物與單鏈引物與單鏈DNA模板結模板結合合( (堿基互補配對堿基互補配對) ) 延伸：延伸：70 75 Taq酶酶的作用下，從引的作用下，從引物起始物起始進行互補鏈的延伸進行互補鏈的延伸（5）結果：結果：每循環一次，目的基因可增加一倍，每循環一次，目的基因可增加一倍，呈呈指數形式（指數形式（2n）擴增。擴增。 PC

6、R擴增儀擴增儀PCR技術擴增技術擴增與與DNA復制復制的比較的比較PCR技術技術DNA復制復制相相同同點點原則原則原料原料條件條件不不同同點點解旋解旋方式方式場所場所酶酶結果結果堿基互補配對原則堿基互補配對原則4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸模板、能量、模板、能量、DNA聚合酶聚合酶DNA在在高溫變性高溫變性解旋解旋解旋酶解旋酶催化催化體外體外復制復制細胞內細胞內熱穩定熱穩定的的DNA聚合酶聚合酶細胞內的細胞內的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成形成整個整個DNA分子分子3、人工合成法人工合成法如果如果基因比較小基因比較小，核苷酸序列又已知核苷酸序列又已知，也可，也可以通過以通過DNA

7、合成儀合成儀用化學方法直接人工合成。用化學方法直接人工合成。二、基因表達載體的構建二、基因表達載體的構建 基因工程的核心基因工程的核心1、構建表達載體的構建表達載體的目的目的： 使使目的基因在受體細胞中穩定存在目的基因在受體細胞中穩定存在，并且，并且可以可以 遺傳遺傳給下一代；給下一代； 使目的基因能夠使目的基因能夠表達表達和和發揮作用發揮作用。2、基因表達載體的基因表達載體的構成及作用構成及作用：復制原點復制原點目的基因目的基因啟動子啟動子終止子終止子標記基因標記基因啟動子：啟動子： 位于基因首端的位于基因首端的一段有特殊結構的一段有特殊結構的DNA片斷片斷，它是它是RNA聚合酶識別和結合的

8、部位聚合酶識別和結合的部位；作用：作用：驅動基因轉錄出驅動基因轉錄出mRNA終止子：終止子：位于基因尾端的位于基因尾端的一段有特殊結構一段有特殊結構DNA片斷。片斷。作用：作用：使轉錄終止使轉錄終止標記基因：標記基因：為了為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而，從而將有目的基因的細胞篩選出來將有目的基因的細胞篩選出來（如（如抗生素抗性抗生素抗性基因基因）。）。注意：注意：啟動子與終止子不同于起始密碼和終止密碼啟動子與終止子不同于起始密碼和終止密碼 啟動子與終止子啟動子與終止子位于位于DNA上，上，是是DNA片段片段，與與基因的基因的轉錄有關轉錄有關。起始密碼和終

9、止密碼起始密碼和終止密碼位于位于mRNA上上， 是是3個相鄰個相鄰的堿基的堿基，與，與翻譯翻譯（蛋白質的合成）（蛋白質的合成）有關有關。 克隆載體克隆載體與與表達載體表達載體的構成：的構成： 二者都有標記基因和復制原點兩部分二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片片 段。段。表達載體表達載體在克隆載體基礎上在克隆載體基礎上增加增加了了啟動啟動 子、終止子，子、終止子，啟動子、終止子啟動子、終止子對于目的基因對于目的基因 表達必不可少。表達必不可少。三、將目的基因導入受體細胞三、將目的基因導入受體細胞1、轉化轉化：目的基因進入受體細胞目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內，并且在受體細胞內內維

10、持穩定和表達維持穩定和表達的過程的過程。2、常用的轉化方法：常用的轉化方法：（1）導入導入植物細胞植物細胞的方法：的方法： 農桿菌轉化法農桿菌轉化法（最常用最常用）a. 農桿菌農桿菌：土壤中的一種微生物，自然條件下土壤中的一種微生物，自然條件下感染雙子葉感染雙子葉植物和裸子植物植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感對大多數單子葉植物沒有感染能力。染能力。 b.農桿菌轉化法的原理農桿菌轉化法的原理：植物受傷時，傷口處細胞會分泌大量植物受傷時，傷口處細胞會分泌大量酚類化合酚類化合物物，吸引農桿菌，吸引農桿菌，農桿菌農桿菌Ti質粒上的質粒上的T-DNA可可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體以

11、轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的的DNA上上。 目的基因目的基因插入插入Ti質粒的質粒的T-DNA上上 c. 過程過程： 優點：優點：經濟、有效經濟、有效 基因槍法基因槍法單子葉植物常用單子葉植物常用的方法，的方法，成本較高成本較高。 花粉管通道法花粉管通道法簡便經濟簡便經濟 （我國（我國轉基因抗蟲棉轉基因抗蟲棉）（2）導入導入動物細胞動物細胞的方法：的方法： 常用常用方法：方法： 顯微注射法顯微注射法 常用的受體細胞：常用的受體細胞： 受精卵受精卵目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動物 流程：流程：

12、（3）導入導入微生物細胞微生物細胞的方法：的方法： 原核生物特點：原核生物特點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少 方法：方法：用用Ca2+（或或CaCl2溶液溶液）處理細胞）處理細胞 感受態細感受態細胞胞 表達載體與感受態細胞混合表達載體與感受態細胞混合 感感受態細胞吸收受態細胞吸收DNA分子，完成轉化。分子，完成轉化。四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定1、轉基因生物、轉基因生物DNA上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因（1）方法：方法：DNA分子雜交分子雜交技術技術（2）過程：過程：. 提取提取轉基因生物的轉基因生物的基因組基因組DNA.

13、 用用放射性同位標記放射性同位標記的目的基因的的目的基因的DNA片段片段 做做探針探針，與轉基因生物的基因組雜交與轉基因生物的基因組雜交， 若若顯示出雜交帶顯示出雜交帶，表明目的基因已插入表明目的基因已插入染染 色體色體DNA中。中。2、目的基因、目的基因是否轉錄出是否轉錄出mRNA（1）方法：方法：分子雜交分子雜交技術技術（2）過程：過程：. 提取提取轉基因生物的轉基因生物的mRNA. 用用放射性同位標記放射性同位標記的目的基因的的目的基因的DNA片段片段 做做探針探針，與與轉基因生物的轉基因生物的mRNA雜交雜交， 若若顯示出雜交帶顯示出雜交帶，表明目的基因轉錄出表明目的基因轉錄出 mRN

14、A。3、檢測目的基因、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質是否翻譯成蛋白質（1）方法：方法：抗原抗原抗體雜交抗體雜交 （2）原理：原理： 抗原與抗體的特異性結合抗原與抗體的特異性結合（3）過程：過程：. 提取提取轉基因生物的轉基因生物的蛋白質蛋白質. 用用針對目的基因表達的蛋白質針對目的基因表達的蛋白質（抗原）的（抗原）的 抗體（放射性標記）抗體（放射性標記），與與轉基因生物的轉基因生物的蛋蛋 白質（抗原）雜交白質（抗原）雜交，若，若顯示出雜交帶顯示出雜交帶，表表 明目的基因已形成相應的蛋白質明目的基因已形成相應的蛋白質。除了上述除了上述分子水平分子水平的鑒定，有時還需進行的鑒定，有時還需進行個體個體

15、生物學水平生物學水平的鑒定：的鑒定：比如做比如做抗蟲、抗病抗蟲、抗病的的接種實驗接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度；以確定是否有抗性以及抗性的程度；或對或對基因工程產品與天然產品的功能進行基因工程產品與天然產品的功能進行活性比較活性比較，以確定功能是否相同，以確定功能是否相同【特別提示】【特別提示】關注關注“操作程序操作程序”中的四個易混點中的四個易混點(1)(1)目的基因的插入位點不是隨意的。目的基因的插入位點不是隨意的。目的基因目的基因 應插入到啟動子與終止子之間的部位應插入到啟動子與終止子之間的部位。(2)(2)目的基因與載體相連接時，可能出現目的基因與載體相連接時，可能出現3種連接種連接 方式方式，如，如目的基因目的基因目的基因、目的基因目的基因、目的基因 載體、載體載體、載體載體載體。為了防止目的基因或載。為了防止目的基因或載 體自連，基因工程中體自連，基因工程中常用常用2種不同的限制酶種不同的限制酶對對 目的基因和載體進行目的基因和載體進行切割切割，并保證目的基因，并保證目的基因 的的定向連接定向連接（啟動子在其前，終止子在其（啟動子在其前，終止子在其 后，保證目的基因正常轉錄）后，保證目的基因正常轉錄）(3)(3)基因工程基因工程4步曲中，只有步曲中，只有第第3步步“將目的