1、胰島素受體底物2在宮內發育遲緩大鼠胰腺組織中的表達【摘要】 目的 觀察宮內發育遲緩對胰島細胞上胰島素信號分子胰島素受體底物2的影響，探討胎兒宮內發育遲緩個體發生胰島素抵抗的分子機制。方法 通過低蛋白飲食法建立宮內發育遲緩大鼠的動物模型，應用免疫組織化學法研究胰島素受體底物2在正常飲食組大鼠及低蛋白飲食組大鼠在生后0，3，8周胰腺組織中的表達。結果 低蛋白飲食致宮內發育遲緩大鼠在生后0，3，8周胰腺組織中胰島素受體底物2蛋白的表達水平均顯著低于正常飲食組大鼠胰腺組織中胰島素受體底物2的表達水平。結論 宮內發育遲緩對胰島細胞上胰島素信號分子胰島素受體底物2的影響導致胰島素信號轉導通路障礙，這可能是

2、胎兒宮內發育遲緩鼠成年后發生胰島素抵抗的原因之一。 【關鍵詞】 胎兒生長遲緩； 胎兒/胚胎學； 受體，胰島素； 大鼠； 動物，實驗 【Abstract】 Objective To observe the expression of insulin receptor substrate2 （IRS2）on intrauterine growth retardation（IUGR），and to investigate molecular mechanisms for insulin resistance in IUGR rats.Methods An IUGR animal model was

3、established by protein malnutrition during pregnancy.Study the expression of IRS2 / 132 by immunohistochemistry at newborn，at 3 weeks and 8 weeks respectively on control group fed with common diet and IUGR lowprotein diet group.Results The level of protein of IRS2 at newborn，3 weeks and 8 weeks of I

4、UGR was significantly lower than that of control group respectively.Conclusion IUGR can induce the obstacle of signal transduction and effecter molecule by impacting on IRS2，which might be one of the molecular mechanisms of IUGR with insulin resistance at adult. 【Key words】 Fetal growth retardation；

5、 Fetus/Embryology； Receptors，insulin； Rats； Animals，laboratory 胎兒宮內發育遲緩（Intrauterine growth retardation,IUGR）是一種常見的妊娠并發癥。國內IUGR發生率為6.3916.3%。其病因復雜，母親孕期并發高血壓、糖尿病或營養不良以及孕期吸煙和酗酒都可以導致IUGR，IUGR不僅近期可發生多種并發癥，遠期亦可發生深遠影響。近10年來的流行病學調查證明，出生時體格大小與成年后的疾病如冠心病、高血壓、2型糖尿病有密切關系。2型糖尿病和高血壓常常同時發病，并與脂代謝異常，肥胖和胰島素抵抗密切相關，其被

6、稱為代謝綜合征，其共同發病基礎為胰島素抵抗，又稱為胰島素抵抗綜合征。本研究擬通過孕期蛋白質營養不良法建立IUGR動物模型，研究IUGR個體生后0，3，8周胰腺組織中胰島素受體底物2（Insulin receptor substrate2，IRS2）蛋白表達的變化，探討IUGR個體發生胰島素抵抗的分子機制，為代謝綜合征的早期防治提供理論依據。 1 材料與方法 1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠15只，體質量230280 g，雄性3只，雌性12只，雌性均為處女鼠，大鼠由中國醫科大學實驗動物中心提供（動物合格證號SYXK（遼）20030019），大鼠雌雄比例按41合籠，次晨89時涂片，以鏡下見精

7、子作為受孕第1天。孕鼠按受孕順序隨機分成低蛋白組和正常對照組，正常對照組孕鼠飼以標準飼料（熱卡為15.83 kJ/g，蛋白質含量為23%）；低蛋白組孕鼠自妊娠第1天起飼以低蛋白飼料（熱卡為15.58 kJ/g，蛋白質含量為8%），飼料均由中國醫學科學院實驗動物研究所配制。所有孕鼠均自然分娩，稱量12 h內新生仔鼠體質量精確到0.01 g。IUGR診斷標準：新生鼠出生體質量低于正常對照組出生平均體質量的2個標準差。 1.2 標本取材 隨機挑選8只不同窩別的IUGR新生仔鼠、3周齡鼠及8周齡鼠和相同數量的對照組新生仔鼠、3周齡鼠及8周齡鼠，處死后提取胰腺組織，置4%多聚甲醛中固定,備作石蠟切片。

8、1.3 主要試劑 IRS2一抗為羊抗鼠IgG，二抗為抗羊IgG，購自美國Santa Cruz公司。 1.4 方法 采用免疫組織化學染色法，將切片貼附于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，進行免疫組織化學染色，染色步驟如下：二甲苯脫蠟，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽煮沸，正常山羊血清封閉，一抗（工作濃度150）濕盒中4 過夜，二抗37 孵育30 min，辣根酶標記鏈霉卵白素37 孵育30 min，聯苯二胺顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封固。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。陽性判斷為細胞漿和細胞膜染為棕黃色。 1.5 圖像分析 采用Metan Lorph/EvolutionMp5.0/Bx5

9、1 Vs/Jp VIC/Olympus顯微圖像分析系統，對生后0，3，8周3個時期組織化學結果分析，每個時期選取8張切片，測其陽性反應部位平均密度值。 1.6 統計學分析 采用SPSS 12.0統計軟件包進行統計處理，測定結果用±s表示，P0.05為差異有統計學意義。 2 結果 2.1 一般特性比較 低蛋白組IUGR發生率為54%（27/50），明顯高于正常對照組的4.1%（2/48），差異有統計學意義（P0.001）。與正常對照組體質量（4.935±0.320）g相比，低蛋白組出生體質量（3.923±0.220）g明顯降低，差異有統計學意義（P0.01）。 2.

10、2 不同時期胰腺組織中IRS2蛋白表達情況 0周低蛋白組胰腺組織中IRS2蛋白表達結果見圖1。其陽性反應部位的平均密度值（0.806±0.064）明顯低于正常對照組（0.875±0.035），差異有統計學意義（P<0.01），見圖2。3周低蛋白組胰腺組織中IRS2蛋白表達結果見圖3。其陽性反應部位的平均密度值（0.754±0.092）明顯低于正常對照組（0.855±0.063），差異有統計學意義（P<0.01），見圖4。8周低蛋白組胰腺組織中IRS2蛋白表達結果見圖5。其陽性反應部位的平均密度值（0.480±0.08

11、2）明顯低于正常對照組（0.570±0.089），差異有統計學意義（P<0.01），見圖6。 3 討論 1993年Barker等最先提出了有關胎兒生長遲緩遠期有害的影響。Godfrey等1通過研究發現，發育早期的關鍵階段宮內不良環境的刺激可以引起人體結構和功能的持續改變，這一改變是一個漫長的程序化的過程，動物實驗和人群研究表明宮內環境的異常將對脂肪組織和胰腺細胞功能產生長期的影響。 胰島細胞主要通過分泌胰島素起調節血糖、血脂作用，胎兒期營養不良可影響胎兒胰島細胞形態發育及功能成熟，胎兒宮內后期及新生兒期，胰島細胞分裂加快，數量增多，這一增殖過程受營養物質的調節。因此，早

12、期營養不良尤其是胰島細胞發育的關鍵期，營養不良可能會造成胰島細胞結構和功能的永久性損害。 現在已經明確，要實現胰島素的正常生物學效應需要具備以下條件2：（1）細胞分泌正常結構和數量的胰島素，胰島素釋放的脈沖頻率及振幅正常；（2）所分泌的胰島素轉運至胰島素靶細胞；（3）胰島素與靶細胞膜上的特異受體相結合；（4）胰島素與受體結合后胰島素信號向細胞內傳導，激活一系列細胞內下游的級聯過程和網絡途徑。 目前，胰島素信號轉導通路的改變是研究的焦點，1995年，Harbeek等通過逆轉錄-聚合酶鏈反應方法證明了在胰島細胞上有胰島素受體信號轉導通路，其主要通路為PI3K信號轉導途徑和鈣通道及其相關途徑3。在胰

13、島細胞上分布的主要是IRS1和IRS2，IRS1在整個胰島上廣泛分布，IRS2則主要分布在胰島的外周，二者有不同的生理作用。IRS1通過PI3K和鈣通道及其相關途徑控制胰島素的分泌；IRS2則至少可以通過PI3K和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activator protein kinase，MAPK）兩條通路調控細胞的生長、存活和有絲分裂3。PI3K是一種脂質激酶，在介導胰島素的代謝效應中起關鍵性作用。 外源性胰島素和（或）葡萄糖刺激生產的胰島素與胰島細胞膜上的胰島素受體結合后，激活受體的內源性酪氨酸激酶活性，導致自身磷酸化和IRS的酪氨酸磷酸化?；罨腎RS遷移到細胞膜，磷酸酪氨酸結

14、合域將磷酸酪氨酸錨定在IRS酪氨酸激酶上。其后，酪氨酸磷酸化的IRS通過其SH2結構域招募到PI3K的85 ku的調節亞單位（P85）。P85與磷酸肌醇3磷酸結合，將磷脂酰肌醇-磷酸轉化為磷磷酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸，這些產物是胰島素和其他生長因子的第二信使，成為下游信號分子的錨定位點。其下游的信號分子為磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1和（或）蛋白激酶C的某一亞型。磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1接著激活蛋白激酶B（也稱為Akt）和某一非典型蛋白激酶C亞型?；罨牡鞍准っ窧通過絲/蘇氨酸磷酸化使糖原合成激酶3失活，同時激活另一個蛋白激酶哺乳動物的雷帕霉素靶點，導致下游的70 kuS6激酶（p70S6K）

15、磷酸化而激活4。而哺乳動物的雷帕霉素靶點激酶也可以作為“ATP感受器”激活p70S6K而不需要通過Ca2+/cAMP，從而控制蛋白的合成，加強基因的轉錄，促進細胞肥大，并產生其他生物效應5。蛋白激酶B也可以直接使某些轉錄因子絲/蘇氨酸磷酸化，導致細胞有絲分裂。IRS1主要通過此途徑發揮作用。而IRS2可通過上述途徑控制機體蛋白的合成和細胞的肥大。 此外，其還可以激活Ras途徑。Ras可沿兩條通路被激活：（1）活化的胰島素受體激活IRS2蛋白，后者將信號傳至適配蛋白生長因子受體結合蛋白2，它再與信號蛋白GDP/GTP交換因子相互作用，將失活的RasGDP轉變成活化的RasGTP，進而激活Ras；

16、（2）胰島素受體不經過IRS2蛋白，直接使信號蛋白Shc的酪氨酸磷酸化，Shc再與適配蛋白生長因子受體結合蛋白2相結合，經信號蛋白GDP/GTP交換因子激活Ras。激活的RasGTP募集Raf絲氨酸激酶，依次使MAPK激酶（MAPKK，也稱MEK）、MAPK（細胞外信號調節激酶1和亞型）磷酸化。激活的MAPK繼而激活其他蛋白激酶，如p90核糖體亞單位（p90RSK），產生一系列生理效應，如誘導基因轉錄、參與調控細胞凋亡等。 本研究發現，低蛋白飲食致宮內發育遲緩大鼠在生后0，3，8周胰腺組織中IRS2蛋白的表達水平均顯著低于正常對照組大鼠胰腺組織中IRS2蛋白的表達水平，產生胰島素抵抗，從而促進

17、了糖尿病的發生。 綜上所述,宮內發育遲緩導致子代自生命早期胰島素信號轉導通路障礙，這種病理生理改變持久存在,構成IUGR個體胰島素抵抗的分子基礎。(本文圖16見封三)【參考文獻】 1 Godfrey KM,Barker DJ.Fetal nutrition and adult diseaseJ.Am J Clin Nutr，2000，71(5 Suppl):1344S1352S.2 Kume S.The molecular basis and prospects in pancreatic developmentJ.Dev Growth Differ，2005，47(6):367374.3 Pende M,Kozma SC,Jaquet M,et al.Hypoinsulinaemia,glucose intolerance and diminished betacell size in S6K1deficient miceJ.Nature，2000，408(6815):994997.4 Ohsugi M,CrasMéneur C,Zhou Y,et al.Glucose and insulin trea