1、2021年12月14日17時(shí)22分1The Significance of Gene Manipulating in Medical Develapments第1頁(yè)/共58頁(yè)基因操作技術(shù)在醫(yī)學(xué)方面的價(jià)值主要包括：（1） 疾病相關(guān)基因和疾病分子機(jī)制的分析家；（5）高效率、低成本地生產(chǎn)用于疾病防治的生物 活性蛋白質(zhì)、細(xì)胞、器官。（2） 建立新的疾病診斷方法-基因診斷；（4）糾正人類基因缺陷的方法）糾正人類基因缺陷的方法-基因治療；基因治療；（3）發(fā)展出新的法醫(yī)學(xué)鑒定方法-法醫(yī)學(xué)鑒定；2021年12月14日17時(shí)22分2第2頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分3一、疾病相關(guān)基因分析 要確認(rèn)

2、某一疾病的相關(guān)基因，就是利用不同的方法將各種基因確定到染色體的實(shí)際位置上，并分析基因的結(jié)構(gòu)和疾病狀態(tài)下基因的突變。 1911年Wilson將紅綠色盲基因首次定位到X染色體上，開創(chuàng)了人類基因定位的先河。 1968年Donahue利用系譜分析將Duffy血型基因定位于1號(hào)染色體上，這是人類首次將基因定位于常染色體上。第3頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分4 20世紀(jì)80年代以前，可進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的疾病相關(guān)基因僅限于個(gè)別功能異常非常明確，基因表達(dá)產(chǎn)物純化較易的遺傳性疾病，尤其是血液系統(tǒng)疾病如鐮刀狀貧血、地中海貧血等。 20世紀(jì)80年代中期以后，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是重組DNA技術(shù)

3、水平的提高和PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使疾病相關(guān)基因的鑒定與克隆工作得以迅速發(fā)展。第4頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分5（一）功能性克隆(functional cloning)從對(duì)一種致病基因的功能理解出發(fā)，克隆該致病從對(duì)一種致病基因的功能理解出發(fā)，克隆該致病基因。實(shí)際上是利用純化蛋白克隆致病基因。基因。實(shí)際上是利用純化蛋白克隆致病基因。u獲得純化蛋白后的基因克隆方式有兩種：獲得純化蛋白后的基因克隆方式有兩種：獲取部分氨基酸序列，推導(dǎo)出獲取部分氨基酸序列，推導(dǎo)出mRNA序列，合成序列，合成 寡核苷酸探針，篩選寡核苷酸探針，篩選 cDNA 文庫(kù)；從基因組文庫(kù)文庫(kù)；從基因組文庫(kù) 獲取其基

4、因組序列。獲取其基因組序列。 制備特異性抗體，篩選表達(dá)型制備特異性抗體，篩選表達(dá)型cDNA文庫(kù)。文庫(kù)。只要能獲得部分氨基酸序列就可以進(jìn)行基因克隆。只要能獲得部分氨基酸序列就可以進(jìn)行基因克隆。第5頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分6u根據(jù)根據(jù)mRNAmRNA表達(dá)差異來(lái)克隆疾病相關(guān)基因：表達(dá)差異來(lái)克隆疾病相關(guān)基因：（1 1）削減雜交）削減雜交(subtractive hybridization)(subtractive hybridization)（2 2）差異顯示（）差異顯示（differential displaydifferential display）PCRPCR（3 3）基于

5、）基于PCRPCR的削減雜交法的削減雜交法 將正常與異常的同一組織的mRNA或cDNA文庫(kù)進(jìn)行雜交，篩選出表達(dá)有差異的克隆； 能很靈敏地?cái)U(kuò)增兩個(gè)mRNA樣品中有差異的片段，克隆后進(jìn)行分析； 將前兩種方法結(jié)合起來(lái)，克服了削減雜交靈敏度低，差異顯示PCR假陽(yáng)性高的缺點(diǎn)。第6頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分7缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 大多數(shù)癥狀的生理、生化變化很復(fù)雜，對(duì)與之有關(guān)的蛋白質(zhì)了解甚少，對(duì)其基因表達(dá)主要組織也知之不多。 不同組織甚或至于同一組織的蛋白質(zhì)與mRNA的“正常”差異很難與特異性差異區(qū)別。 功能性克隆技術(shù)成熟、方法直接、費(fèi)用較低，迄今仍是克隆基因的首選策略。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：第7頁(yè)/共5

6、8頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分8（二）定位克隆（positional cloning）從一種致病基因的染色體定位出發(fā)，逐步縮小范圍，最后克隆該基因 。系統(tǒng)的定位克隆包含：遺傳學(xué)分析：遺傳學(xué)分析：分子生物學(xué)分析：分子生物學(xué)分析： 包括交換分析和連鎖不平衡分析以確定致病基因的染色體定位； 包括染色體異常（缺失、易位等）分析和基因文庫(kù)的篩選與基因克隆。第8頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分9杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD) 致病基因的克隆：致病基因的克隆： 首先，遺傳學(xué)的家族連鎖分析確定了致病基因位于Xp21（性染色體X短臂第2區(qū)第1條帶）。 將病人的Xp21 DNA與正常

7、人的雜交，從而減掉了相同的基因序列，最后剩余的序列即為病人缺失的基因。第9頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分10新的技術(shù)非定位候選基因克隆策略(position-independent candidate gene approaches)：定位候選基因克隆策略 ( positional candidate gene approaches)： 直接根據(jù)分子病理學(xué)變化和基因組作圖中各種基因產(chǎn)物功能的了解預(yù)測(cè)出候選致病基因。 一旦致病基因的染色體定位得以確認(rèn)，可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供的基因序列數(shù)據(jù)鑒定出候選致病基因。第10頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分11（三）基

8、因結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物功能的分析利用對(duì)于某基因結(jié)構(gòu)和功能的理解，分析其與利用對(duì)于某基因結(jié)構(gòu)和功能的理解，分析其與疾病的關(guān)系、是否有突變、突變產(chǎn)物的致病機(jī)制。疾病的關(guān)系、是否有突變、突變產(chǎn)物的致病機(jī)制。獲得未知基因后可進(jìn)一步進(jìn)行下列工作：1 1克隆和分析全長(zhǎng)克隆和分析全長(zhǎng)cDNAcDNA序列：序列：根據(jù)根據(jù)cDNA序列推出序列推出該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列；該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列；2 2克隆基因全序列：克隆基因全序列：分析存在的內(nèi)含子，啟動(dòng)子分析存在的內(nèi)含子，啟動(dòng)子以及其調(diào)節(jié)位點(diǎn)，探討基因表達(dá)調(diào)控方式；以及其調(diào)節(jié)位點(diǎn)，探討基因表達(dá)調(diào)控方式；3 3確定基因在的位置和拷貝數(shù)：確定基因在的位置和拷貝

9、數(shù)：染色體中定位多染色體中定位多用原位雜交法，拷貝數(shù)可用用原位雜交法，拷貝數(shù)可用Southern雜交法確定。雜交法確定。第11頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分124 4基因表達(dá)譜分析：基因表達(dá)譜分析：該基因在不同組織、細(xì)胞的表該基因在不同組織、細(xì)胞的表達(dá)狀態(tài)。達(dá)狀態(tài)。Northern blotting和點(diǎn)陣雜交檢測(cè)和點(diǎn)陣雜交檢測(cè)mRNA的的水平。水平。Western blotting檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)。檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)。5 5基因表達(dá)產(chǎn)物的功能分析：基因表達(dá)產(chǎn)物的功能分析：（1）找已知功能的同源蛋白或同源結(jié)構(gòu)域。）找已知功能的同源蛋白或同源結(jié)構(gòu)域。（2）在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)該基因，觀察

10、各種功能影響。）在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)該基因，觀察各種功能影響。（3）在細(xì)胞內(nèi)抑制該基因表達(dá)，分析細(xì)胞功能變化；）在細(xì)胞內(nèi)抑制該基因表達(dá)，分析細(xì)胞功能變化； 建立基因剔除小鼠，分析基因產(chǎn)物功能。建立基因剔除小鼠，分析基因產(chǎn)物功能。（4）分析與該基因產(chǎn)物相互作用分子，或者是相互）分析與該基因產(chǎn)物相互作用分子，或者是相互 作用的蛋白分子或核酸。作用的蛋白分子或核酸。第12頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分13二、制造生物活性蛋白二、制造生物活性蛋白 基因工程技術(shù)的發(fā)展在醫(yī)學(xué)上最重要的成就表現(xiàn)在治療用生物活性蛋白或疫苗的生產(chǎn)和使用。 通過(guò)基因的克隆，可獲得具有特定生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這尤其適用

11、于那些來(lái)源特別有限的蛋白質(zhì)，或自然界本不存在的蛋白質(zhì)。 克隆基因的表達(dá)可在大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳類細(xì)胞或整體動(dòng)物體內(nèi)。第13頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分14生物安全性：生物安全性：活性的可控性：活性的可控性：資源和生產(chǎn)成本：資源和生產(chǎn)成本： 未發(fā)現(xiàn)諸有如此類豬胰島素、牛腦垂體提取的生長(zhǎng)激素、人血VIII因子的副作用。 基因工程產(chǎn)品的可重復(fù)性要好于生物提取物。 無(wú)資源依賴性，生產(chǎn)成本也明顯低于生物提取。基因工程產(chǎn)品比生物提取產(chǎn)品有明顯的優(yōu)勢(shì)：基因工程產(chǎn)品比生物提取產(chǎn)品有明顯的優(yōu)勢(shì)：第14頁(yè)/共58頁(yè)產(chǎn)品名稱產(chǎn)品名稱適應(yīng)癥適應(yīng)癥乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原人

12、胰島素人胰島素生長(zhǎng)激素生長(zhǎng)激素組織肝淳蛋白激活物（組織肝淳蛋白激活物（TPA）-干擾素干擾素-干擾素干擾素-干擾素干擾素促紅細(xì)胞生成素促紅細(xì)胞生成素（EPO）*粒細(xì)胞刺激因子（粒細(xì)胞刺激因子（GSF）粒細(xì)胞粒細(xì)胞-巨噬細(xì)巨噬細(xì)胞刺激因子（GMSF）*表表皮生長(zhǎng)因子（皮生長(zhǎng)因子（EGF）第第VIII因子因子第第IX因子因子白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素2（IL-2）白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素3（IL-3）白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素4（IL-4）干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF）抗抗CD3抗體抗體CAMPATH-1HCAMPATH-1H（淋巴細(xì)胞抗體）（淋巴細(xì)胞抗體）抗內(nèi)毒素抗體抗內(nèi)毒素抗體抗腫瘤壞死因子抗體抗腫

13、瘤壞死因子抗體注射疫苗用于預(yù)防乙型肝炎注射疫苗用于預(yù)防乙型肝炎糖尿病糖尿病垂體功能低下垂體功能低下急性心肌梗塞急性心肌梗塞慢性髓系白血病，骨髓瘤慢性髓系白血病，骨髓瘤乙型肝炎，艾滋病人并發(fā)乙型肝炎，艾滋病人并發(fā)kaposis肉瘤肉瘤多發(fā)性硬化（試用）多發(fā)性硬化（試用）抗抗貧血貧血*腎性貧血腎性貧血化化療后白細(xì)胞和內(nèi)體骨髓移植再療后白細(xì)胞和內(nèi)體骨髓移植再生生*嚴(yán)重?zé)齻麌?yán)重?zé)齻巡⊙巡，B血友病血友病A，B腫瘤免疫治療腫瘤免疫治療化療后促進(jìn)髓母細(xì)胞形成化療后促進(jìn)髓母細(xì)胞形成免疫缺陷病，腫瘤，免疫佐劑免疫缺陷病，腫瘤，免疫佐劑骨髓移植前擴(kuò)增骨髓干細(xì)胞骨髓移植前擴(kuò)增骨髓干細(xì)胞器官移植器官移植類風(fēng)

14、濕性關(guān)節(jié)炎，非何杰金氏淋巴瘤類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，非何杰金氏淋巴瘤革蘭氏陽(yáng)性菌感染革蘭氏陽(yáng)性菌感染嚴(yán)重炎癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重炎癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎表7-1 臨床正在使用或試用的部分基因工程產(chǎn)品2021年12月14日17時(shí)22分15第15頁(yè)/共58頁(yè)質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化連接酶連接酶轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染篩選篩選2021年12月14日17時(shí)22分16第16頁(yè)/共58頁(yè) 是在編碼蛋白質(zhì)基因的特定位置引入堿基替代、是在編碼蛋白質(zhì)基因的特定位置引入堿基替代、產(chǎn)生小的堿

15、基缺失或插入，使其編碼的蛋白質(zhì)的一產(chǎn)生小的堿基缺失或插入，使其編碼的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。 在合成在合成PCRPCR引物時(shí)，除了在定點(diǎn)誘變的位置引引物時(shí)，除了在定點(diǎn)誘變的位置引入相應(yīng)的突變（點(diǎn)突變、小片段插入或缺失）外，入相應(yīng)的突變（點(diǎn)突變、小片段插入或缺失）外，其余序列與模板完全配對(duì)其余序列與模板完全配對(duì) PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物中就引入特定的突變；將PCR產(chǎn)物克隆表達(dá)，可獲得定點(diǎn)突變的蛋白質(zhì)。PCR誘變：2021年12月14日17時(shí)22分171.蛋白質(zhì)工程中的定點(diǎn)誘變技術(shù)第17頁(yè)/共58頁(yè) 包括表達(dá)載體的構(gòu)建、受體細(xì)胞的建立和表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化等技術(shù)和策略。 涉及目的基因的

16、克隆、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的加工及分離純化等過(guò)程，需要在適合的表達(dá)系統(tǒng)中完成。 表達(dá)系統(tǒng)可根據(jù)受體細(xì)胞的不同分為和。2021年12月14日17時(shí)22分18第18頁(yè)/共58頁(yè)大多是穿梭載體2021年12月14日17時(shí)22分19第19頁(yè)/共58頁(yè)大腸桿菌（大腸桿菌（E.coliE.coli）表達(dá)體系最常用）表達(dá)體系最常用 優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、迅速、經(jīng)濟(jì)而又適合大規(guī)模生產(chǎn)。 2021年12月14日17時(shí)22分20第20頁(yè)/共58頁(yè) 在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的體系主要有酵母、昆蟲細(xì)胞（桿狀病毒）、哺乳動(dòng)物和高等植物。2021年12月14日17時(shí)22分21 常用的瞬時(shí)表達(dá)宿主是來(lái)源于非洲綠猴腎C

17、V-1細(xì)胞的COS細(xì)胞。 常用的穩(wěn)定表達(dá)宿主細(xì)胞是來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的CHO細(xì)胞。第21頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分22（二）轉(zhuǎn)基因技術(shù)簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenic technique) 利用DNA重組技術(shù)在動(dòng)物體內(nèi)引入可遺傳給子代的外源基因的技術(shù)。被導(dǎo)入的目的基因Microinjection into the Pronucleus of a Bovine Zygote ：目的基因的受體動(dòng)物第22頁(yè)/共58頁(yè)基本原理 采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將目的基因?qū)胧芫训募?xì)胞核內(nèi)或著床前的胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入受體動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。 2021年12月14日17時(shí)

18、22分23u基因的導(dǎo)入方式：顯微注射法(最常用)胚胎干細(xì)胞法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 第23頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分24u顯微注射是最早發(fā)展，也是最為有效的外源顯微注射是最早發(fā)展，也是最為有效的外源 基因?qū)敕椒ā；驅(qū)敕椒ā⒛康幕蛑苯幼⑸涞绞芫褍?nèi)，目的基因即可與 受精卵的染色體整合，最終可產(chǎn)生帶有外源基因的 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物發(fā)育后，在其體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中都有 外源基因的存在和表達(dá)，并可將該基因遺傳給子代。可以在攜帶外源基因的載體內(nèi)加上組織特異性啟動(dòng) 子，從而在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)限定表達(dá)外源基因的組 織和器官。第24頁(yè)/共58頁(yè)顯微注射法建立轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)路線目的基因供體

19、動(dòng)物受精卵受體動(dòng)物輸卵管動(dòng)物幼崽轉(zhuǎn)基因動(dòng)物微注射移植妊娠出生分子檢測(cè)2021年12月14日17時(shí)22分25第25頁(yè)/共58頁(yè)1982年哈佛“制造”的“超級(jí)小鼠” 其中有七只帶有融合基因，六只生長(zhǎng)迅速，每只體重平均可達(dá)44g，為同窩無(wú)融合基因小鼠平均體重29g的1.5倍。 把這種重組的質(zhì)粒注射入小鼠受精卵中，經(jīng)過(guò)充分發(fā)育后分娩出了21小鼠。 將大鼠生長(zhǎng)激素基因與小鼠金屬硫蛋白基因的啟動(dòng)子順序連接，再引入質(zhì)粒中。轉(zhuǎn)基因小鼠正常小鼠2021年12月14日17時(shí)22分26第26頁(yè)/共58頁(yè)2000年法國(guó)科學(xué)家“制造”出發(fā)出綠色熒光的兔子“Alba”。 改造水母的熒光蛋白基因使熒光蛋白發(fā)光率提高了2倍，

20、再將該基因顯微注射轉(zhuǎn)入到兔子的受精卵中，由此培養(yǎng)出了會(huì)發(fā)光的兔子Alba。 在普通光線下它看上去與其它同類沒(méi)有區(qū)別，但在較暗光線下它的身體就會(huì)放射出奇異的綠光。 2021年12月14日17時(shí)22分27第27頁(yè)/共58頁(yè)u乳腺生物反應(yīng)器的誕生 1987年Gordon等將組織型纖溶酶原激活劑(tPA)與小鼠乳清蛋白基因的啟動(dòng)子構(gòu)成重組基因，培育出了37只在乳汁中能表達(dá)tPA 的轉(zhuǎn)基因小鼠。2021年12月14日17時(shí)22分28第28頁(yè)/共58頁(yè)動(dòng)物動(dòng)物多肽藥物多肽藥物用途用途綿羊綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫治療氣腫綿羊綿羊CFTR治療治療 囊腫性纖維化囊腫性纖維化綿羊綿羊組織型纖溶

21、酶原活化因子組織型纖溶酶原活化因子治療血栓治療血栓綿羊綿羊凝血凝血VIII因子、因子、IX因子因子治療血友病治療血友病綿羊綿羊纖維蛋白原纖維蛋白原傷口愈合傷口愈合豬豬組織型纖溶酶原活化因子組織型纖溶酶原活化因子治療血栓治療血栓豬豬凝血凝血VIII因子、因子、IX因子因子治療血友病治療血友病山羊山羊人蛋白質(zhì)人蛋白質(zhì) C治療血栓治療血栓山羊山羊抗血栓因子抗血栓因子 3治療血栓治療血栓山羊山羊谷氨酸脫羧酶谷氨酸脫羧酶治療治療I型糖尿病型糖尿病山羊山羊Pro542治療愛(ài)滋治療愛(ài)滋 病病牛牛a-乳清白蛋白乳清白蛋白抗炎癥抗炎癥牛牛凝血凝血VIII因子因子治療血友病治療血友病牛牛纖維蛋白原纖維蛋白原傷口愈

22、合傷口愈合牛牛膠原蛋白膠原蛋白 I, II組織修復(fù)組織修復(fù), 治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎牛牛乳鐵蛋白乳鐵蛋白治療腸道感染治療腸道感染, 感染性關(guān)節(jié)炎感染性關(guān)節(jié)炎牛牛人血清白蛋白人血清白蛋白維護(hù)血液體積維護(hù)血液體積雞雞, 牛牛, 山羊山羊單克隆抗體單克隆抗體用于疫苗生產(chǎn)用于疫苗生產(chǎn)2021年12月14日17時(shí)22分29第29頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分30第30頁(yè)/共58頁(yè)u顯微注射法等傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有隨機(jī)性和不可預(yù)見性、整合率、表達(dá)低等式缺陷。外源基因的拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)都是隨機(jī)的；小鼠,大鼠,兔,牛,豬,綿羊陽(yáng)性率分別為26%、44%、15%、0.7%、0.9%、0

23、.9%。 整合率極低，得到的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物數(shù)量更少。采用非受精卵還出現(xiàn)嵌合體；受到宿主染色體上整合位點(diǎn)的影響，大部分轉(zhuǎn) 基因表達(dá)水平較低。2021年12月14日17時(shí)22分31第31頁(yè)/共58頁(yè) 即體細(xì)胞克隆技術(shù)，是用顯微操作、電融合等方法將動(dòng)物體細(xì)胞的細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)個(gè)體的去除細(xì)胞核的卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成為個(gè)體。2021年12月14日17時(shí)22分32 核轉(zhuǎn)移技術(shù)可使一個(gè)細(xì)胞變成一個(gè)個(gè)體，所產(chǎn)生的個(gè)體攜帶的遺傳物質(zhì)與細(xì)胞核供體的遺傳物質(zhì)完全一樣，是一種無(wú)性繁殖過(guò)程，即克隆(clone)。（三）核轉(zhuǎn)移技術(shù)簡(jiǎn)介第32頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分331.動(dòng)物克隆轉(zhuǎn)移的核末經(jīng)修飾第3

24、3頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分34第34頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分35多利羊誕生于多利羊誕生于1996年年7月月5日，日，1997年首年首次向公眾披露。次向公眾披露。被美國(guó)被美國(guó)科學(xué)科學(xué)雜雜志評(píng)為志評(píng)為1997年世界十年世界十大科技進(jìn)步的第一項(xiàng)，大科技進(jìn)步的第一項(xiàng)，也是當(dāng)年最引人注目也是當(dāng)年最引人注目的國(guó)際新聞之一。的國(guó)際新聞之一。科學(xué)家認(rèn)為，科學(xué)家認(rèn)為，“多多利利”的誕生標(biāo)志著生的誕生標(biāo)志著生物技術(shù)新時(shí)代的來(lái)臨。物技術(shù)新時(shí)代的來(lái)臨。u1997年2月27日Nature報(bào)道，維爾穆特(Wilmut)和坎貝爾(Campbell)利用克隆技術(shù)培育出一只小母羊。第

25、35頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分36 坎貝爾利用克隆多利時(shí)冷凍保存下來(lái)的，同一只母羊乳腺組織樣本，克隆出“多利四羊組”。第36頁(yè)/共58頁(yè) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以作為天然的生物工廠，合成多肽和蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，制備藥物、抗體和疫苗等，稱為動(dòng)物生物反應(yīng)器(animal bioreactor)。 生物藥物生產(chǎn)主要通過(guò)乳腺生產(chǎn)(動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器)，少數(shù)通過(guò)腎臟和膀胱。 用于表達(dá)的生物反應(yīng)器包括動(dòng)物血液、泌尿系統(tǒng)、精囊腺、乳腺等，還包括禽蛋和昆蟲（例如家蠶）個(gè)體等。2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的制備 轉(zhuǎn)移的核經(jīng)過(guò)修飾2021年12月14日17時(shí)22分37第37頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月1

26、4日17時(shí)22分38u1997年6月伊恩維爾穆特(Wilmut)報(bào)道用基因改造過(guò)的胎兒成纖維細(xì)胞為核供體，獲得了表達(dá)人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊“波莉”。成功克隆出攜帶有人凝血因子成功克隆出攜帶有人凝血因子X(jué)基因的綿羊早期基因的綿羊早期 胚胎成纖維細(xì)胞；胚胎成纖維細(xì)胞；以該細(xì)胞系為核供體移植到去核卵母細(xì)胞中，經(jīng)以該細(xì)胞系為核供體移植到去核卵母細(xì)胞中，經(jīng) 過(guò)處理后將卵母細(xì)胞植入假孕綿羊體內(nèi)發(fā)育。過(guò)處理后將卵母細(xì)胞植入假孕綿羊體內(nèi)發(fā)育。獲得獲得3只能高水平表達(dá)人凝血因子只能高水平表達(dá)人凝血因子X(jué)（125g/ml） 的綿羊。的綿羊。第38頁(yè)/共58頁(yè) 人體移植器官短缺是一個(gè)世界性難題，研究人員把目

27、光移向動(dòng)物以尋求可替代移植器官。 豬器官的體積、形狀和DNA基本與人類相似，是理想的器官供應(yīng)者，但這種器官移植的主要問(wèn)題之一是免疫排斥。 三、制造用于移植的細(xì)胞、組織和器官三、制造用于移植的細(xì)胞、組織和器官2021年12月14日17時(shí)22分39第39頁(yè)/共58頁(yè)解決辦法之一：通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，特別是基因打靶技術(shù)：通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，特別是基因打靶技術(shù)：敲除敲除-半乳糖抗原決定基因，再結(jié)合克隆技術(shù)，半乳糖抗原決定基因，再結(jié)合克隆技術(shù)，培育大量不含免疫排斥的轉(zhuǎn)基因克隆豬的器官。培育大量不含免疫排斥的轉(zhuǎn)基因克隆豬的器官。 向供體器官基因組向供體器官基因組敲入敲入某種調(diào)節(jié)因子，抑制某種調(diào)節(jié)因子，抑制-半半乳

28、糖抗原決定基因的表達(dá)；乳糖抗原決定基因的表達(dá)；2021年12月14日17時(shí)22分40第40頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分41（一）基因打靶技術(shù)簡(jiǎn)介 可在細(xì)胞水平進(jìn)行，從而建立新的細(xì)胞系；也可在動(dòng)物整體水平進(jìn)行，以建立基因剔除動(dòng)物。 基因打靶(Gene targeting)，是一種在胚胎干細(xì)胞(ES)技術(shù)和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)之上，定向改變生物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。基因敲除(gene knockout)：定向敲除某種基因基因敲入(gene knockin)：定向替代某種基因第41頁(yè)/共58頁(yè)2021年12月14日17時(shí)22分42基本過(guò)程包括：基本過(guò)程包括： 用同源基因片段構(gòu)建含有目的

29、基因的載體；用同源基因片段構(gòu)建含有目的基因的載體；用顯微注射法將含有目的基因的載體導(dǎo)入用顯微注射法將含有目的基因的載體導(dǎo)入ES細(xì)胞，細(xì)胞， 與與ES細(xì)胞染色體的相應(yīng)基因發(fā)生同源重組，替代細(xì)胞染色體的相應(yīng)基因發(fā)生同源重組，替代 ES細(xì)胞中原有的基因；細(xì)胞中原有的基因；將基因替代了的將基因替代了的ES細(xì)胞注入動(dòng)物的囊胚中，使其細(xì)胞注入動(dòng)物的囊胚中，使其 與囊胚中的細(xì)胞共同組成囊胚內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)；與囊胚中的細(xì)胞共同組成囊胚內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)；將囊胚移植到假孕動(dòng)物的子宮中，使之發(fā)育成一將囊胚移植到假孕動(dòng)物的子宮中，使之發(fā)育成一 種既有含目的基因細(xì)胞又有原有細(xì)胞的嵌合體；種既有含目的基因細(xì)胞又有原有細(xì)胞的嵌合體；將

30、嵌合體動(dòng)物與正常動(dòng)物交配，最終篩選出基因?qū)⑶逗象w動(dòng)物與正常動(dòng)物交配，最終篩選出基因 替代的純合子動(dòng)物。替代的純合子動(dòng)物。第42頁(yè)/共58頁(yè)跨物種感染：跨物種感染： 一般不會(huì)感染人的病毒，通過(guò)異種器官移植提供的種間細(xì)胞親密接觸，可能感染人或者與人的病毒重組形成更危險(xiǎn)更致命的病毒，而且免疫系統(tǒng)受到抑制的移植受體比一般人更容易被感染。 更加重要的是，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物帶的未知病毒是否會(huì)從移植受體擴(kuò)散出去，從而傳播到其他人造成疫病大流行，引起流行病？風(fēng)險(xiǎn)2021年12月14日17時(shí)22分43第43頁(yè)/共58頁(yè)組織工程 是利用人體自身細(xì)胞和組織工程的理論與方法，使原先缺損的組織和器官沿著設(shè)計(jì)好的支架、模型順其自

31、然地成長(zhǎng)起來(lái)發(fā)。2021年12月14日17時(shí)22分44多能干細(xì)胞的定向分化多能干細(xì)胞的定向分化第44頁(yè)/共58頁(yè) 2006年，京都大學(xué)的山中伸彌(Shinya Yamanaka) 從24個(gè)候基因中篩選出4個(gè)與胚胎干細(xì)胞多能性更為密切相關(guān)的基因：Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4； 證實(shí)了分化的細(xì)胞可以通過(guò)少數(shù)幾個(gè)因子的外源導(dǎo)入而被重編程到具有多能性的狀態(tài)。 將它們導(dǎo)入到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和鼠尾成纖維細(xì)胞，成功地將其重編程為具有胚胎干細(xì)胞多能性的細(xì)胞，稱之為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell, iPS cell) 。（二）誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能性干細(xì)胞技術(shù)

32、2021年12月14日17時(shí)22分45第45頁(yè)/共58頁(yè)1. Oct3/4Oct-4，也稱，也稱Oct-3，屬于，屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一員。轉(zhuǎn)錄因子家族的一員。是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子。是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子。是全能性的標(biāo)志；是全能性的標(biāo)志；能夠促使能夠促使ICM形形成、維持胚胎干細(xì)成、維持胚胎干細(xì)胞未分化前狀態(tài)，胞未分化前狀態(tài)，并促進(jìn)其增殖。并促進(jìn)其增殖。2021年12月14日17時(shí)22分46第46頁(yè)/共58頁(yè)2.SOX2基因基因 SOX2基因是編碼轉(zhuǎn)錄因子的主控基因（master genes）家族的一個(gè)成員。 轉(zhuǎn)錄因子是些與DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)的蛋

33、白質(zhì)。2021年12月14日17時(shí)22分47第47頁(yè)/共58頁(yè)3.癌癥基因癌癥基因c-MYC 癌癥基因c-MYC，是一種最容易過(guò)渡表現(xiàn)于人類的致癌基因， 它對(duì)某些成體干細(xì)胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES細(xì)胞的分化。2021年12月14日17時(shí)22分48第48頁(yè)/共58頁(yè)4.Klf4 Krueppel-like factor 4，KLF4上皮鋅指轉(zhuǎn)錄上皮鋅指轉(zhuǎn)錄因子因子Klf4 (舊稱舊稱GKLF) 調(diào)節(jié)體外細(xì)胞的增生調(diào)節(jié)體外細(xì)胞的增生與分化與分化 。 2021年12月14日17時(shí)22分49第49頁(yè)/共58頁(yè)誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)流程式2021年12月14日17時(shí)22分50第50頁(yè)/共58頁(yè)制定