1、會計學1質粒改造質粒改造(gizo)修改修改第一頁，共30頁。載體載體外源外源DNADNA片段片段外源外源DNADNA插入插入剪切剪切引入宿主細胞引入宿主細胞abbA重重組組Ab抗性篩選抗性篩選重組篩選重組篩選DNADNA重組重組(zhn z)(zhn z)技術技術第1頁/共30頁第二頁，共30頁。質粒改造質粒改造(gizo)歷程歷程閱讀閱讀(yud)質粒圖譜質粒圖譜實驗實驗(shyn)常見問題及注意事項常見問題及注意事項 領域最新進展或現實意義領域最新進展或現實意義第2頁/共30頁第三頁，共30頁。 天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克

2、隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工(rngng)構建。 第一階段（1977年前）：天然質粒和重組質粒的利用，如pSC101, colE1,pBR313和pBR322。 第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區和新的遺傳標記基因。如pUC系列載體。 第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。 發展發展(fzhn)概概況況質粒改造質粒改造(gizo)歷程歷程第3頁/共30頁第四頁，共30頁。 1）pBR322為4.36kb的環狀雙鏈DNA，其堿基序列已經全部清楚。最早

3、應用于基因工程的載體之一。 2）由pSF2124、pMB8及pSC101三個親本質粒經復雜的重組過程構建而成的。 3）把pBR322用限制性內切酶切去某片段，換上合用的表達組件，就可以構建成工作所需的新載體。許多實用(shyng)的質粒載體都是在pBR322的基礎上改建而成。pBR322pBR322重要(zhngyo)的大腸桿菌質粒載體第4頁/共30頁第五頁，共30頁。4）過百個限制性內切酶切點，一種限制性內切酶只有單一切口的位點也多達數十個，幾乎具備了所有常用限制酶都能切開并插入目的(md)基因的優越條件。 此外，pBR322DNA，被限制性內切酶消化后產生的片段大小均已知道，可以作為核酸電

4、泳的分子質量標準。第5頁/共30頁第六頁，共30頁。pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr松弛松弛(sn ch)(sn ch)型復制型復制 pBR322pBR322： 氯霉素可擴增氯霉素可擴增拷貝數拷貝數 50 - 100 / 50 - 100 / cellcell用于基因用于基因(jyn)(jyn)克克隆隆 第6頁/共30頁第七頁，共30頁。pUCpUC質粒系列質粒系列(xli)(xli) pUC質粒系列(xli)也是在pBR

5、322基礎上改建成的。 它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和復制起始點。去除了pBR322的tetr區段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ 基因及其啟動子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker. 第7頁/共30頁第八頁，共30頁。三個顯著特點： （1）分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數（每個細胞含500-700個拷貝）。 （2）含易于檢測是否有外源DNA插入的標記基因LacZ，可利用-互補原理進行藍白篩選。 （3）多克隆位點區（MCS）由人工合成的多個單一酶切位點構成。 其MCS區與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上

6、克隆的目的基因直接(zhji)轉移到M13mp載體，進行DNA測序和體外突變等研究。第8頁/共30頁第九頁，共30頁。NoImage476bp476bp片段含有片段含有E.coliE.coli的的lacZlacZ基基因的因的 5- 5-序列序列(xli)(xli)，表達，表達半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的片段。片段。LacZLacZ的上游包括乳糖操縱子上的上游包括乳糖操縱子上的啟動子的啟動子PlacPlac和操縱基因和操縱基因O O。lacZlacZ之內是之內是M13M13的多功能連接器的多功能連接器。第9頁/共30頁第十頁，共30頁。閱讀閱讀(yud)質粒圖譜質粒圖譜第10頁/共30頁第十一頁，共

7、30頁。第11頁/共30頁第十二頁，共30頁。第12頁/共30頁第十三頁，共30頁。第13頁/共30頁第十四頁，共30頁。第14頁/共30頁第十五頁，共30頁。第15頁/共30頁第十六頁，共30頁。第16頁/共30頁第十七頁，共30頁。實驗實驗(shyn)常見問題及注意事項常見問題及注意事項酶切問題酶切問題(wnt)(wnt)分分析析 連接注意事項連接注意事項 結果鑒定結果鑒定第17頁/共30頁第十八頁，共30頁。 非特異性擴增非特異性擴增 拖尾拖尾 假陽性假陽性(yngxng)(yngxng) PCR PCR常見問題分析常見問題分析(fnx)(fnx)第18頁/共30頁第十九頁，共30頁。1

8、.1.模板模板: :含有含有(hn yu)(hn yu)抑制物，抑制物，含量低含量低2.2.BufferBuffer對樣品不合適對樣品不合適3.3.引物設計不當或者發生降解引物設計不當或者發生降解4.4.反應條件：退火溫度太高，延反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短伸時間太短 原因原因(yunyn)對對策策1.1.純化模板或者使用試劑盒提純化模板或者使用試劑盒提取模板取模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2.2.更換更換BufferBuffer或調整濃度或調整濃度3.3.重新設計引物（避免鏈間二聚體重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新和鏈內二級結構）或者換一管新

9、引物引物4.4.降低退火溫度、延長延伸時間降低退火溫度、延長延伸時間現象：正對照有條帶，而樣品則無正對照有條帶，而樣品則無；第19頁/共30頁第二十頁，共30頁。 非特異性擴增非特異性擴增 現象：現象：PCRPCR擴增后出現的條帶與預計的大擴增后出現的條帶與預計的大小小(dxio)(dxio)不一致，或大或小，或者同時不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。第20頁/共30頁第二十一頁，共30頁。1.1.引物特異性差引物特異性差2.2.模板或引物濃度過高模板或引物濃度過高3.3.酶量過多酶量過多4.4.Mg2+Mg2+濃度偏高濃度偏高5.5

10、.退火退火(tu hu)(tu hu)溫度偏低溫度偏低6.6.循環次數過多循環次數過多 原因原因(yunyn)對對策策1.1.重新設計引物或者使用巢式重新設計引物或者使用巢式PCRPCR2.2.適當降低模板或引物濃度適當降低模板或引物濃度3.3.適當減少酶量適當減少酶量4.4.降低鎂離子濃度降低鎂離子濃度5.5.適當提高退火溫度或使用二階段適當提高退火溫度或使用二階段溫度法溫度法6.6.減少循環減少循環(xnhun)(xnhun)次數次數 第21頁/共30頁第二十二頁，共30頁。 拖尾拖尾 現象現象(xinxing)(xinxing)：產物在凝膠上呈：產物在凝膠上呈SmearSmear（彌散）

11、狀態。（彌散）狀態。 M 1 2第22頁/共30頁第二十三頁，共30頁。1.1.模板不純模板不純2.2.BufferBuffer不合適不合適3.3.退火溫度偏低退火溫度偏低4.4.酶量過多酶量過多5.5.dNTPdNTP、Mg2+Mg2+濃度偏高濃度偏高6.6.循環次數循環次數(csh)(csh)過多過多 原因原因(yunyn)對對策策1.1.純化模板純化模板2.2.更換更換BufferBuffer3.3.適當提高退火溫度適當提高退火溫度4.4.適量用酶適量用酶5.5.適當降低適當降低dNTPdNTP和鎂離子和鎂離子(lz)(lz)的濃度的濃度6.6.減少循環次數減少循環次數第23頁/共30頁

12、第二十四頁，共30頁。 假陽性（篩選轉基因、檢測(jin c)基因表達情況)原因：靶序列或擴增產物(chnw)的交叉污染 現象：空白對照出現目的(md)擴增產物對策：1.1.操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；2.2.除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。及加樣槍頭等均應一次性使用。3.3.各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。 第24頁/共30頁第二十五頁，共30頁。第25頁/共30頁第二十六頁，