1、吸附柱色譜分離技術(shù)吸附柱色譜分離技術(shù)色譜分離技術(shù)在藥物研究中色譜分離技術(shù)在藥物研究中具有重要意義具有重要意義柱色譜分離特點(diǎn)柱色譜分離特點(diǎn) 柱色譜分離與薄層色譜類似，是靠洗脫劑把分離的各組分逐個(gè)洗脫下來的過程，故也稱洗脫色譜。 由于色譜柱填充的吸附劑的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于薄層板，因而柱色譜可用于分離量比較大（克數(shù)量級(jí)）的物質(zhì)。所以作為較大量樣品的制備分離，柱色譜優(yōu)于薄層色譜。吸附柱色譜分離原理吸附柱色譜分離原理利用欲分離的混合物中各組分分配在固定相和洗脫劑之間，被吸附的性質(zhì)不同，而相互得以分離。化合物被吸附作用越強(qiáng)，該化合物溶解在洗脫劑中越少，沿洗脫劑移動(dòng)的距離則越小。反之，越多。常壓柱色譜常壓柱色譜裝柱

2、裝柱上樣上樣洗脫洗脫合并合并1.裝柱裝柱所用吸附固定相一般為硅膠，氧化鋁，粒度要求100-160目或160目以上。吸附劑粒度越小，分離度越大，但洗脫速度越吸附劑粒度越小，分離度越大，但洗脫速度越慢。慢。Rf值相差較大時(shí)，應(yīng)用硅膠100-160目，可上樣30mg/g硅膠，更多的情況下硅膠量為10mg/g硅膠（即分離1g 樣品需要100g 硅膠）。應(yīng)用氧化鋁時(shí)，粒度要求應(yīng)用氧化鋁時(shí)，粒度要求100150目，分離1g樣品需要2050g氧化鋁。(1) 干法裝柱在柱子上端放一漏斗，直接加入硅膠。輕輕敲打?qū)游鲋蛏舷抡饎?dòng)層析柱，使填裝均勻，再加一層石英砂，然后加入洗脫劑，使硅膠潤濕。必要時(shí)加壓或減壓以除

3、去氣泡，加速溶劑化速度。(2) 濕法裝柱將吸附劑硅膠與一定量溶劑調(diào)成懸漿狀，快速倒入柱管中，打開活塞，使溶劑慢慢流出，吸附劑慢慢下降而均勻沉入色譜柱底。吸附劑填料完畢,一般再覆蓋0.5cm厚的石英砂。2.上樣上樣（1）樣品能被流動(dòng)相溶解）樣品能被流動(dòng)相溶解將其中極性溶劑盡可能的用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除后，加入少許流動(dòng)相稀釋。待將吸附劑上面的多余洗脫劑放出，直到柱內(nèi)液體表面降至石英砂表面時(shí)，停止放出洗脫劑。將樣品用滴管或漏斗沿柱子內(nèi)壁直接加入柱中。樣品稀釋要盡可能用少的洗脫劑，然后用最少量洗脫劑洗滌器皿與層析柱內(nèi)壁，洗滌完畢，開放活塞，使液體漸漸放出，液面降至石英砂下端時(shí)，再加入流動(dòng)相洗脫。（2）樣品不

4、能被流動(dòng)相溶解）樣品不能被流動(dòng)相溶解可選擇極性大的溶劑溶解。如氯仿，丙酮，乙醇，甲醇，四氫呋喃，吡啶，免用DMSO,DMF沸點(diǎn)較高溶劑。再加入適量的硅膠于溶劑中（一份樣品+ 約5份柱填料），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸去溶劑至干，讓樣品均勻地涂布在固定相表面上，然后通過漏斗裝于柱子上端。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)，一定要加防爆球，以防樣品硅膠爆沸。3.洗脫洗脫（1）洗脫劑的選擇應(yīng)以TLC檢測(cè)為依據(jù)。被分離物質(zhì)的最佳Rf值應(yīng)在0.2-0.5內(nèi)。被分離的2個(gè)點(diǎn)之間Rf值應(yīng)盡可能的大，越大越好。（2）洗脫劑應(yīng)不斷加入，保持一定高度。（3）洗脫液收集洗脫液采用等份法收集。（4）控制洗脫液流出速度。不能太快，一般以1-2滴/秒為

5、宜。4.合并合并洗脫液按編號(hào)TLC點(diǎn)樣展開，將Rf值相同者合并，濃縮，最后進(jìn)一步純化。注意！注意！1.吸附劑表面應(yīng)盡量平整，并水平。2.吸附劑充填時(shí)必須非常均勻，不可出現(xiàn)空氣泡、隙縫等。3.樣品層應(yīng)盡量薄。干柱色譜干柱色譜是指用填充劑干裝成柱，然后進(jìn)行層析分離的一種方法。實(shí)際上是制備薄層的一種改進(jìn)。即由薄層板改為柱狀，采用塑料薄膜或玻璃柱。將吸附劑填充到塑料薄膜柱中，把欲分離混合物置于柱子頂端，加展開劑展開，當(dāng)展開劑到達(dá)柱底部時(shí)即完成分離。用小刀沿著分離部位將柱子切開或?qū)⑽絼┩瞥觯瑥姆侄蔚奈絼┲杏萌軇┨崛∷璧幕衔铩?吸附劑吸附劑常用氧化鋁或硅膠為吸附劑。一般干柱層析吸附劑粒度20030

6、0目較好（硅膠），干柱色譜樣品與吸附劑比例1：3001：500。2.裝柱裝柱與一般柱層析一樣。3.上樣與展開：上樣與展開：將混合物溶于展開劑中;或?qū)悠啡苡谌軇┲校尤?倍量的吸附劑，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干后。均勻地加載于柱子上端，上面再覆蓋少量石英砂。加入展開劑，使柱的頂端保持有35厘米厚的液面。展開時(shí)展到柱子底端即可，然后去除色譜柱支撐物。4檢查與分離檢查與分離按色帶或紫外下的色帶用小刀將柱子切開，將各段吸附劑分別放在索氏提取器中，溶劑提取。快速柱色譜快速柱色譜快速柱色譜可克服普通柱分離的缺陷，它具有快速省時(shí)、分離效率高、簡單易行的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于0.01-10g的樣品，Rf 值0.15的情況下，在

7、10-15分鐘可快速得到分離。1.裝柱、上樣裝柱、上樣同常壓柱色譜快速柱色譜的條件與步驟：快速柱色譜的條件與步驟：（1）選用對(duì)欲分離成分在TLC 板上有較好的分離效能的洗脫劑，Rf 值0.35；Rf0.15。（2）選擇合適的層析柱，內(nèi)裝粒度230-400目的硅膠，高度5-6inch。（3）加入洗脫劑，在壓力下快速將硅膠中空氣排除。（4）上樣后，加洗脫劑洗脫，控制(壓力)流速2.0in/min （約5cm/min）。利用柱后減壓使洗脫劑迅速通過固定相從而很好的分離樣品的色譜技術(shù)。具有快速，簡易，高效，價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)。減壓柱色譜減壓柱色譜1. 裝柱裝柱將吸附劑裝入漏斗或短柱中，輕輕拍緊或減壓拍打或從頂

8、端擠壓，直至吸附劑緊密，最后變得堅(jiān)硬。吸附劑的高度一般不超過5cm。對(duì)于微量分離，樣品100mg,可采用直徑為0.51cm 色譜柱或漏斗，吸附劑高度為5cm，一般固定相用量為1015：1 倍。加大吸附劑與樣品比例，可提高分離度。2.上樣上樣放掉真空后，常壓下加入低極性溶劑于吸附劑表面上，減壓使溶劑均勻流過吸附劑。如有空隙，需要重裝。使柱子抽干后，重復(fù)12 次，即可準(zhǔn)備上樣。用低極性溶劑或洗脫劑（如石油醚、正己烷）溶解樣品。常壓下小心加入柱頂端，再加入洗脫劑或溶劑覆蓋吸附劑表面，慢慢減壓，使樣品在柱頂端形成樣品層。可也采用固體上樣法。即先將樣品溶于極性溶劑，加入510 份吸附劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，加到吸附劑的表面上，然后進(jìn)行洗脫。3.洗脫與收集洗脫與收集一