1、實(shí)驗(yàn)一 小鼠肝組織DNA的提取及鑒定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、 掌握動(dòng)物組織DNA提取的方法；2、 掌握紫外分光光度法檢測、鑒定DNA濃度和純度的方法。【實(shí)驗(yàn)原理】獲得相當(dāng)純度和完整性的基因組DNA，可用于DNA酶切圖譜、多態(tài)性分析、基因診斷、構(gòu)建基因組文庫等。因此，DNA樣品質(zhì)量的好壞將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。較理想的DNA樣品應(yīng)達(dá)到以下三點(diǎn)要求：不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；最大程度地降低蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染；排除RNA分子的污染和干擾。DNA以核蛋白形式存在于細(xì)胞中，提取DNA的原則是即要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等成分分離，又要保持DNA分子的完整。本實(shí)驗(yàn)中，用陰

2、離子去垢劑十二烷基磺酸鈉（SDS）消化破裂細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白變性沉淀，DNA從核蛋白中游離分開；為控制組織中脫氧核糖核酸酶（DNase）對(duì)DNA的降解，加入檸檬酸鈉或乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）以除去激動(dòng)該酶的金屬離子，SDS也能使DNase變性失活；蛋白酶K可水解蛋白質(zhì)，消化DNA酶；分離后的DNA用飽和酚/氯仿抽提除去蛋白質(zhì)，接著用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用無水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因組DNA。260nm處DNA有最大吸收峰，測DNA的A260，可計(jì)算其濃度。而蛋白質(zhì)在280nm處有最大吸收峰，可測定A260nm/A280nm比值，檢測DNA的純度

3、，該比值介于1.82.0之間。【實(shí)驗(yàn)器材和試劑】1、動(dòng)物小白鼠2、設(shè)備移液器、臺(tái)式離心機(jī)、水浴箱、陶瓷研缽等；751紫外分光光度計(jì)、石英比色皿、洗瓶、濾紙等。3、試劑（1）基因組DNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K（7）生理鹽水，4貯存（8）無水乙醇、70%乙醇【操作步驟】1、制備肝勻漿迅速處死小白鼠，稱取新鮮肝臟組織50 mg，用預(yù)冷生理鹽水洗去血液，濾紙吸干后剪碎組織，將剪碎組織放于組織勻漿器或研缽中研磨，同時(shí)加入300 l Buffer CL。將肝勻漿液放入EP管，加入1.5

4、 l蛋白酶K，漩渦震蕩10 s，55孵育直到組織溶解（約1小時(shí)）。2、提取DNA（1）加入1.5 l RNase A，顛倒混勻，37孵育15-60 min。（2）冰上孵育1分鐘使樣品迅速冷卻。（3）加入1/3體積的Buffer PP，渦旋震蕩20 s，12000 rpm離心3 min。（4）將上清轉(zhuǎn)移到個(gè)新的離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，可見絮狀沉淀（纖維狀DNA）從溶液中析出。12000 rpm離心1 min，棄上清。（5）加入300 l 70乙醇，顛倒數(shù)次以洗滌DNA沉淀。12000 rpm離心1 min，棄上清，室溫干燥15 min。（6）加入50 l Buffer GE溶解

5、DNA（如果DNA的量比較大，可以65孵育以促進(jìn)DNA的溶解），室溫保存待測。3、DNA濃度和純度的測定取0.1 ml DNA樣品，加蒸餾水至1 ml，在751紫外分光光度計(jì)上測A260值和A280值。計(jì)算：DNA濃度（g/ml）= A260×50×10 （請(qǐng)問系數(shù)50、10是如何得來的？） DNA純度 = A260nm/A280nm【注意事項(xiàng)】（1）由于DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，為便于提取DNA，肝臟的破碎要嚴(yán)格控制好。即要盡可能的將細(xì)胞膜破碎，又要盡可能多保留完整的細(xì)胞核，以保留6070的完整細(xì)胞核為宜。為避免DNA過度斷裂，不宜用電動(dòng)研磨器制備勻漿。在提取過程中，染色

6、體會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，因此分離基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量在溫和的條件下操作，如盡量減少酚/氯仿抽提，混勻過程要輕緩, 以保證得到較長的DNA。（2）用氯仿除去組織蛋白，要不斷振蕩使蛋白質(zhì)變性。如要得到高純度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白質(zhì)。（3）酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)避免接觸皮膚。（4）室溫下干燥時(shí)盡可能使殘留的乙醇揮發(fā)掉（DNA中殘留的乙醇會(huì)影響內(nèi)切酶的活性或電泳時(shí)DNA不下沉），但不要讓DNA完全干燥，否則極難溶解，DNA溶解過程通常需要12-24hr。（5）提取過程應(yīng)盡量保持低溫。（6）在波長260nm紫外線下，1OD的光密度值相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml；單

7、鏈DNA或RNA為40g/ml；單鏈寡核苷酸為20g/ml。據(jù)此來計(jì)算核酸樣品的濃度。紫外分光光度法只用于測定濃度>0.25g/ml的核酸溶液。（7）A260nm/A280nm比值應(yīng)介于1.82.0之間，若比值>2表示DNA樣品中含有較多的RNA，如比值<1.8表明樣品中有蛋白質(zhì)污染。應(yīng)根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，采取不同的方法純化。當(dāng)然也會(huì)出現(xiàn)DNA溶液中既含蛋白質(zhì)又含RNA，其比值介于1.82.0的情況，所以有必要結(jié)合凝膠電泳等方法鑒定有無RNA，或用測定蛋白質(zhì)的方法檢測是否存在蛋白質(zhì)。【結(jié)果】1、A260 = ，A280 = 。2、小鼠肝組織中DNA濃度是 g/ml。3、小鼠肝組

8、織中DNA的A260nm/A280nm比值是 。【思考題】1、 提取和純化的真核組織DNA有何用途？2、 你的A260nm/A280nm比值結(jié)果是否介于1.82.0之間？有何意義？3、 請(qǐng)結(jié)合你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和操作步驟，分析如何檢測和保證DNA的質(zhì)量？實(shí)驗(yàn)二 聚合酶鏈反應(yīng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增小鼠肝組織平滑肌收縮蛋白（SM22）基因【實(shí)驗(yàn)原理】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）用于體外擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段（靶序列）。其原理是通過耐熱DNA聚合酶催化的DNA合成反應(yīng)達(dá)到對(duì)靶序列的擴(kuò)增。反應(yīng)中使用兩條化學(xué)合成的寡核苷酸作為引物

9、，分別與模板DNA兩條單鏈互補(bǔ)，待擴(kuò)增序列片段位于兩條引物之問。PCR擴(kuò)增包括3個(gè)步驟，即變性、退火和延伸。反應(yīng)需要模板、引物、DNA聚合酶和脫氧核糖三磷酸(dNTP)等的參與。反應(yīng)混合液被加熱以使模板DNA雙鏈變性成為二條單鏈，隨后將反應(yīng)混合液冷卻至引物的熔點(diǎn)溫度(Tm)以下，使引物能與靶序列形成雜交雙鏈（退火）。當(dāng)溫度升至72左右時(shí)，反應(yīng)體系中的DNA聚合酶按照模板鏈的序列以堿基互補(bǔ)方式依次把dNTP加至引物的3端，使互補(bǔ)鏈從5 向3方向不斷延伸，直至形成新的DNA雙鏈。通過變性、退火和延伸的一個(gè)循環(huán)可以使靶序列的分子拷貝數(shù)增加一倍。由于每次擴(kuò)增的產(chǎn)物又作為下一次擴(kuò)增的模板，因此反應(yīng)產(chǎn)物的

10、量以指數(shù)形式增長，一個(gè)分子的模板經(jīng)過n個(gè)循環(huán)可得2n個(gè)分子拷貝產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的是小鼠肝組織平滑肌收縮蛋白（SM22）基因，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為541bp。擴(kuò)增所用的上游引物序列為：5-AGTTATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG-3，下游引物序列為：5-GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3。【實(shí)驗(yàn)器材和試劑】1、設(shè)備PCR儀、0.2ml PCR反應(yīng)管、1.5ml離心管、移液器、吸嘴、旋渦混合器。2、試劑（20 l體系）PCR試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技公司）【操作步驟】1、 分別在PCR反應(yīng)管中加入2× PCR mix 10 l、上游和下游引物

11、各2 l、DNA 2 l和H2O 4 l。2、 把PCR反應(yīng)管放人PCR儀，按儀器操作要求啟動(dòng)擴(kuò)增程序。本實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4預(yù)變性5分鐘后進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增，即94變性30s，58退火30s，72延伸1 min。重復(fù)35個(gè)循環(huán)后，于72再延伸10 min，最后4保溫。3、 反應(yīng)結(jié)束后，將PCR反應(yīng)管于12000 rpm離心15s，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。【注意事項(xiàng)】1、由于PCR技術(shù)的靈敏度高，極微量的污染也會(huì)造成擴(kuò)增的假陽性結(jié)果。因此，必須采取相應(yīng)措施避免發(fā)生污染。2、PCR實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立陰性對(duì)照反應(yīng)，即在反應(yīng)體系中不加模板DNA。3、多份樣品同時(shí)擴(kuò)增時(shí)，可配制總的反應(yīng)混合液，并分裝于PCR管中，

12、然后再在各管中分別加入模板。4、臨床診斷用PCR反應(yīng)必須在專門的PCR實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)包括試劑配制室、模板制備室、PCR擴(kuò)增室和產(chǎn)物檢測室等功能區(qū)。PCR實(shí)驗(yàn)中的各個(gè)步驟應(yīng)在相應(yīng)的功能區(qū)中進(jìn)行。5、PCR試劑與模板DNA及樣品應(yīng)分別保存于不同功能區(qū)的冰箱中。6、操作時(shí)應(yīng)戴手套，配制反應(yīng)體系和加模板時(shí)應(yīng)分別使用專用的移液器，所有耗材使用前必須經(jīng)高壓滅菌，用后按規(guī)定處理并丟棄在指定容器中。【結(jié)果】 【思考題】1、 PCR各組分在反應(yīng)中的作用是什么？2、 降低退火溫度、延長變性時(shí)間會(huì)對(duì)反應(yīng)有何影響？實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆窄傊悄z電泳分離DNA的原理和方法。【實(shí)驗(yàn)原理】帶電荷的

13、物質(zhì)在電場中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳。電泳的種類多，應(yīng)用非常廣泛，它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為分離和鑒定核酸的常用技術(shù)。DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA 分子在高于等電點(diǎn)的pH 溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA 片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA ，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，及構(gòu)型不同的DNA 分

14、子。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。熒光染料溴化乙錠(EB)能插入DNA分子中形成復(fù)合物，紫外光照射下EB能發(fā)射熒光，而且熒光的強(qiáng)度正比于核酸的含量。由于EB是致癌劑，現(xiàn)在開發(fā)出了安全的染料，如Syber Green、GelRed、GoldView等。【儀器與試劑】1. 儀器天平、錐形瓶、微波爐（或電爐）、制膠板、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像分析儀（或紫外線透射儀）、微量可調(diào)移液器、移液管、量筒、一次性塑料手套。2. 試劑（1）50×TAE電泳緩沖液：Tris堿24

15、2.0g、冰乙酸57.1 ml、EDTA 63.5g、NaOH 10.0g，加蒸餾水至1000 ml，使用前用蒸餾水稀釋至1×TAE電泳緩沖液。（2）6×loading buffer ：( 0.25溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯氰FF，30%甘油水溶液)或（0.25 溴酚藍(lán)，40(w/v) 蔗糖水溶液），貯存于 4。（3）電泳級(jí)瓊脂糖（Agarose）、溴化乙錠（母液: 將EB 配制成10mg/ml，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲(chǔ)于室溫即可）、DNA Marker、DNA、蒸餾水。【實(shí)驗(yàn)步驟】1配制1.5的瓊脂糖凝膠：精確稱取1.5g電泳級(jí)瓊脂糖，加入100 ml 1×TAE

16、電泳緩沖液，在微波爐里（或電爐）加熱使瓊脂糖顆粒完全溶解（加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜，以減少水份蒸發(fā)），待膠冷卻至55ºC左右時(shí)，加入20µl溴化乙錠（也可先不加EB，而是電泳后再用0.5µg/ml 的EB 溶液浸泡染色），輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。插入合適的梳子，將溶液倒入制膠板中，待凝結(jié)后拔去梳子待用。2. 加樣：將凝膠置于電泳槽，加入1×TAE電泳緩沖液覆蓋膠面即可。各取PCR產(chǎn)物和DNA分子量參照物10 µl DNA加入1µl 6×loading buffer，混合后上樣，分別加入瓊脂糖凝膠孔內(nèi)。加樣時(shí)切勿破壞點(diǎn)樣孔周圍的凝膠。3. 電

17、泳：合上電泳槽蓋，打開電泳儀，控制電壓保持在60-80V，電流在40mA 以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm 時(shí)，停止電泳。4. 染色：未加EB 的膠板在電泳完畢后移入0.5g/ml 的EB 溶液中，室溫下染色20-25 分鐘。5. 觀察和拍照：電泳完成后切斷電源，取出凝膠，置于凝膠成像分析儀上觀察電泳結(jié)果，并照相記錄。或在波長為254 nm的紫外燈下觀察DNA的熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩，以免損傷眼睛。 【注意事項(xiàng)】1影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：（1）DNA大小：遷移速率與log N成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子越大，遷移越慢。分子量相同的空間結(jié)

18、構(gòu)越緊密的電泳越快，如超螺旋>線性DNA。（2）瓊脂糖凝膠濃度：不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA ：瓊脂糖凝膠濃度可分辨的線性DNA片段大小（kb）0.5%5600.7%0.8121.0%0.461.5%0.241.75%0.232.00.13（3）DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀 > 線狀DNA > 單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。（4）所加電壓：低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30。（5）嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率（不提倡加在電泳液中）。（6）電泳緩沖液（0.5×TBE）的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的遷移率。無離子存在時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)；離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性。一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。2溴化乙錠（EB）為致癌劑，