1、第三章 分子熒光分析法16世紀：在礦物和植物提取液中發現熒光；1575年：Monardes植物愈創木切片黃色水溶液天蘭色熒光；1852年：Stokes闡明熒光發射機制（分光計觀測奎寧和葉綠素的熒光，發現熒光波長稍長于入射光的波長認識到熒光為“重新發光”而不是漫射光；1905年：Wood發現氣體分子的共振熒光；1926年:Gaviola直接測定了熒光壽命；1965年：熒光分析在生物分析中廣泛應用；熒光分析法發展簡史分子發光：處于基態的分子吸收能量（電、熱、化學和光能等）被激發至激發態，然后從不穩定的激發態返回至基態并發射出光子，此種現象稱為發光。發光分析包括熒光、磷光、化學發光、生物發光等。 物

2、質吸收光能后所產生的光輻射稱之為熒光和磷光。熒光產生的基本原理熒光產生的基本原理分子發光的類型分子發光的類型可以按兩種不同的辦法加以分類,其中一種以激發的模式加以分類,另一種是按分子激發態的類型來分類. 按分子激發態的類型可分為熒光和磷光,熒光:由第一電子激發單重態所產生的輻射躍遷而伴隨的發光現象.磷光:由最低的電子激發三重態所產生的輻射躍遷而伴隨的發光現象. 按激發模式分類,可分為:a.光致發光:分子因吸收外來輻射的光子能量被激發所產生的發光.b.化學發光:分子的激發能量是由反應的化學能提供.c.生物發光:分子的激發能量是由生物體釋放出來的能量提供.d.熱致發光:由熱活化的離子復合激發模式所

3、引起的發光現象.e.場致發光:由電荷注入激發模式所產生的發光.f.摩擦發光:由摩擦激發模式所產生的發光.處于單線態和三線態下的分子的電子受激發激發單重態：分子吸收能量，電子自旋仍然配對，為單重態，稱為激發單重態，以S1，S2表示激發三重態：分子吸收能量，電子自旋不再配對為三重態，稱為激發三重態，以T1，T2.表示。基態：電子自旋配對多重度=2s+1=1，為單重態，以S0表示。熒光產生的基本原理 處于激發態分子不穩定，通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態 。這些過程包括：1）振動弛豫（Vibrational Relaxation, VR） 在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發態的分子因碰撞

4、將能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，從而從高振動能層失活至低振動能層的過程，稱為振動弛豫。2）內轉換（Internal Conversion，IC） 對于具有相同多重度相同多重度的分子，若較高電子能級的低振動能層與較低電子能級的高振動能層相重疊時，則電子可在重疊的能層之間通過振動耦合產生無輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。去活化過程去活化過程（Deactivation）3）外轉換（External Conversion，EC） 受激分子與溶劑或其它分子相互作用發生能量轉換而使熒光或磷光強度減弱甚至消失的過程，也稱“熄滅”或“猝滅”。4）系間跨躍（Intersystem Conversion，I

5、SC） 系間跨躍是發生在兩個不同多重態之間的無輻射躍遷，如從S1到T1，該躍遷是禁阻的。然而，當不同多重態的兩個電子能層有較大重疊時，處于這兩個能層上的受激電子的自旋方向發生變化，即可通過自旋-軌道耦合而產生無輻射躍遷，該過程稱為系間跨躍。5）熒光發射 分子電子從單重激發態（Kasha規則）的最低振動能級在很短時間（10-9-10-6s）躍遷到基態各振動能層時所產生的光子輻射稱為熒光。由于各種去活化過程的存在，熒光輻射能通常要比激發能量低，或者說，熒光波長大于激發波長（Stokes效應）。6）磷光發射 從單重態到三重態分子間發生系間跨躍躍遷后，再經振動弛豫回到三重態最低振動能層，最后，在10-

6、4-10s內躍遷到基態的各振動能層所產生的輻射。0 0S S光光發發射射（低低振振動動能能層層）1 1T T振振動動弛弛豫豫（高高振振動動能能層層）1 1T T系系間間跨跨躍躍1 1S S磷磷熒光的類型發射機制考慮：瞬時熒光和遲滯熒光（1）.瞬時熒光:通常在吸收激發光后大約10-8s 內發射的,是由激發過程中最初生成的S1電子態所產生的輻射.瞬時熒光可能由處于S1電子態的分子或S1激發態分子與基態分子所形成的激發態二聚體產生的.低濃度(10-6M)芘溶液,熒光是紫色的,熒光光譜有結構特征高濃度(10-3M)芘溶液,熒光是藍色的,熒光光譜沒有結構特征(2).遲滯熒光 物質分子在剛性或粘稠介質中,

7、除了磷光譜外,還可能觀察到另一種長壽命的發射譜帶,但這個發射譜帶波長比磷光譜帶波長要短.往往把這種長壽命發射的譜帶稱為遲滯熒光.遲滯熒光分為E-型遲滯熒光,P-型遲滯熒光和復合熒光三種類型.E-型遲滯熒光:處于T1電子態的分子,經熱活化提高能量后而處于S1電子能態,然后自S1電子態輻射躍遷產生熒光.P-型遲滯熒光: 這類熒光,其S1電子激發分子的布居,是由兩個處于T1電子態的分子相互作用時所引起的,此過程稱為“三重態-三重態粒子湮(yan)沒”,結果產生一個激發單重態分子.復合熒光其第一電子激發單重態分子的布居，是由自由基離子和電子復合或具有相反電荷的兩個自由基離子復合引起的。熒光的類型n比較

8、熒光和激發光的波長考慮：n.斯托克斯（stokes)熒光n.反斯托克斯熒光（antistokes)n.共振熒光.斯托克斯（stokes)熒光 在溶液中觀察到的熒光,其發射的熒光比激發光的波長要長.激發光熒光分子碰撞引起的能量損失S0S1.反斯托克斯熒光（antistokes) 如果在吸收光子的過程又附加熱能給予激發態分子,則發射的熒光波長比激發光的波長短.這種熒光可在高溫的稀薄氣體中觀察到.激發光熒光吸收熱能S0S1.共振熒光 與激發光具有相同波長的熒光,這類熒光在氣體和結晶才有可能發生. 激發光熒光S0S1.瑞利散射 如果激發波長太長，其能量不足以使分子中的電子躍遷到電子激發態，但能將電子激

9、發到基態中較高振動能級。若電子在受激后能量沒有損失并在瞬間（10-12s)內又回到原來的能級。于是便在各個不同的方向發射出與激發光波長相同的輻射。.拉曼散射 被激發至基態中較高振動能級的電子,當返回到比原來稍低的振動能級時,便產生波長略長于激發波長的拉曼散射光.拉曼光的強度遠比瑞利散射和熒光弱. 熒光譜帶有特征波峰,而拉曼光的波長是隨激發光的波長的改變而改變.熒光的檢測 光譜特征 任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發光譜與發射光譜。它們是熒（磷）光定性分析的基礎。1）激發光譜 改變激發波長，測量在最強熒（磷）光發射波長處的強度變化，以激發波長對熒光強度作圖可得到激發光譜。 激發光譜形狀與吸收

10、光譜形狀完全相似，經校正后二者完全相同！這是因為分子吸收光能的過程就是分子的激發過程。 激發光譜可用于鑒別熒光物質；在定量時，用于選擇最適宜的激發波長。發射光譜 發射光譜即熒光光譜。一定波長和強度的激發波長輻照熒光物質，產生不同波長和強度的熒光，以熒光強度對其波長作圖可得熒光發射光譜。 由于不同物質具不同的特征發射峰，因而使用熒光發射光譜可用于鑒別熒光物質。 如右圖所示。i）波長比較 與激發（或吸收）波長相比，熒光發射波長更長，即產生所謂Stokes位移。（振動弛豫失活所致）ii）形狀比較 熒光光譜形狀與激發波長無關。盡管分子受激后可到達不同能層的激發態，但由于去活化（內轉換和振動弛豫）到第一

11、電子激發態的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達第一激發態一樣。 換句話說，不管激發波長如何，電子都是從第一電子激發態的最低振動能層躍遷到基態的各個振動能層。激發光譜與發射光譜的關系激發光譜與發射光譜的關系iii）鏡像對稱 通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對稱關系。 熒光為第一電子激發單重態的最低振動能層躍遷到基態的各個振動能層而形成，即其形狀與基態振動能級分布有關。 吸收光譜是由基態最低振動能層躍遷到第一電子激發單重態的各個振動能層而形成，即其形狀與第一電子激發單重態的振動能級分布有關。 由于激發態和基態的振動能層分布具有相似性，因而呈鏡像對稱。解釋解釋1：能層結構相似性：能層結構相似性F=2.

12、3FI0bc式中， F是熒光分子的熒光量子產率，I0是入射光強度，代表熒光分子的摩爾吸收系數，b代表熒光池厚度, c 代表熒光分子的濃度 。條件：溶液的濃度很稀，但是，如果bc0.05時，則引起熒光猝滅和自吸效應，熒光強度與濃度不成線性關系。熒光強度熒光量子產率及其測量方法n熒光量子產率，它表示物質將吸收的光能轉變成熒光的本領。nF1和F2分別表示待測物質和參比物質的熒光量子產率；F1和F2分別表示待測物質和參比物質的積分熒光強度；A1和A2分別表示待測物質和參比物質在激發波長下的吸光度。(硫酸喹啉在0.05mol/L硫酸中的熒光量子產率為0.55,是測量熒光量子產率時經常使用的一種參照物.)

13、熒光與結構的關系n分子的電子結構n1.鍵n沿核間連線方向由電子云重疊而形成的化學鍵稱為鍵. 鍵可分為共價鍵和配位鍵兩種,共價鍵的兩個電子分別來自兩個原子,配位鍵的兩個電子來自同一原子而后由兩個原子共享.(頭對頭)n2.鍵n當兩個原子的軌道(p軌道)從垂直于成鍵原子的核間連線方向接近,發生電子云的重疊而成鍵.(肩并肩)3.未成鍵電子(n電子)n在元素周期表中,有些元素的原子,其外層電子數多于4(如N,S和O),他們在化合物中往往有未參入成鍵的價電子,這些電子稱為n電子.如右圖甲醛的成鍵情況.4反鍵軌道n物質的分子,除了組成化學鍵的那些能量低的分子軌道外,每個分子還有一系列能量較高的空軌道.這些空

14、軌道稱為反鍵軌道. 有機分子中的價電子排列在能量不同的軌道上.這些軌道的能量高低順序為:軌道軌道 n軌道*軌道 *軌道有機試劑結構與熒光的關系當分子因吸光而被激發到電子激發態后, 他可能以一系列的不同途徑失去本身過剩的能量而返回電子基態,這些途徑有:a.發射熒光b.非輻射衰減(內轉換)c.光化學反應躍遷類型：通常，具有*及n*躍遷結構的分子才會產生熒光。而且具*躍遷的量子效率比n*躍遷的要大得多。強熒光物質往往具有如下特征:a.具有大的共軛結構.b.具有剛性的平面結構c.具有最低的單線電子激發態S1為1,1型d.取代基團為給電子基團分子共軛體系大小對熒光的影響共軛效應：共軛度越大，熒光越強分子

15、共軛體系大小對熒光的影響共軛效應：共軛度越大，熒光越強分子剛性（Rigidity）越強，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機率下降，熒光量子效率提高。共軛大鍵共平面及其剛性的影響聯苯(2)由鍵連接，兩個苯環由于立體結構效應或空間位阻不能共平面，處于最大自由度， F是0.18。芴(1)相當于由一個-CH2-把聯苯的兩個苯環固定在一個平面上，不扭動或轉動，其共平面性比聯苯大，而且剛性強， F接近于1。聯苯芴共軛大鍵共平面及其剛性的影響分子剛性（Rigidity）越強，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機率下降，熒光量子效率提高。熒光素(3)比酚酞（4）多了一個氧橋（-O-)，熒光素在溶液中的熒光很強（

16、0.1M NaOH, F=0.97）酚酞(4)無熒光熒光素酚酞共軛大鍵共平面及其剛性的影響分子剛性（Rigidity）越強，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機率下降，熒光量子效率提高。具有類似結構的三苯甲烷類染料，羅丹明B(5) (乙醇介質，F=0.97）亮綠(6)無熒光羅丹明亮綠共軛大鍵共平面及其剛性的影響分子剛性（Rigidity）越強，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機率下降，熒光量子效率提高。取代基的影響給電子取代基增強熒光（p-共軛），如-OH、-OR、 -NH2、-CN、NR2等；吸電子基降低熒光，如 -COOH、 -C=O、 -NO2、-NO、-X等；取代基的影響重原子降低熒光但

17、增強磷光，如苯環被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，該現象也稱重原子效應。重原子的取代化學環境的影響（1）.溫度的影響（2）.溶劑效應（3）.pH值影響（4）.重原子效應（5）.溶解氧效應（1）.溫度的影響不同溫度下鄰菲羅啉的熒光光譜(在聯苯中) 1. 24; 2. -78;3. -150; 4. -168; 5. -196(oC)熒光量子產率與溫度的關系A.羅丹明的甘油溶液B.硫酸鈾酰的硫酸溶液大多數熒光物質的熒光效率和強度隨著溫度升高而降低.因為溫度的升高增加了分子的內部能量轉化.溫度升高溶液中沒有猝滅劑熒光量子產率的數值與輻射過程和非輻射過程的相對速率有關.輻射過程的速率與溫度

18、無關,因此熒光量子產率的變化反映了非輻射躍遷過程速率的改變.溶液溫度降低 ,介質粘度增大 ,熒光分子與溶劑分子的碰撞猝滅機會減小 ,熒光強度增大 .溫度對熒光強度的影響比較復雜,此時因溫度對分子的擴散,活化,分子內部能量轉化和溶液中各種平衡都有一定的影響.如猝滅劑與熒光物質分子之間的碰撞,則熒光強度隨溫度升高而降低.或者這兩種分子形成復合物也會使熒光強度隨溫度升高而降低.溶液中含有猝滅劑（2）.溶劑效應熒光體吸收和再發射之間存在一定的能量損失,從而產生斯托克斯位移.此種現象是由振動弛豫,激發態熒光體偶極矩的改變引起的周圍溶劑分子中電子的重排,溶劑分子圍繞激發態偶極的重新定向和熒光體與溶劑分子之

19、間的特殊作用.溶質,溶劑分子間的相互作用,是偶極子間的靜電作用,氫鍵,電荷轉移等因素能改變熒光分子的量子產率.Ru(phen)2(dppz)2+在幾種代表性的溶劑中的發光光譜.Ru(phen)2(dppz)2+（3）.pH值影響 如果熒光物質是一種弱酸或弱堿,溶液的pH改變將對熒光強度產生較大的影響. 在金屬離子測定中,溶液pH的改變將會影響到金屬離子與有機試劑所生成的熒光配合物的穩定性以及配合物的組成,并進一步影響它們的熒光性質. 在pH3-4,如Ca2+與2,2-二羥基偶氮苯形成1:1配合物,發熒光. 在pH6-7,如Ca2+與2,2-二羥基偶氮苯形成1:2配合物,無熒光.（4）.重原子效

20、應 往熒光物質中加入Br-, I-等鹵素離子的水溶液，則造成熒光猝滅,稱為“外部重原子效應”. 此種現象被認為是鹵素與熒光分子形成弱的電荷轉移型絡合物,加大了系間竄躍(S1 T1 )而產生的.a.外部重原子效應表 金屬-8-羥基喹啉絡合物的重原子效應在熒光性金屬配合物中,隨著中心金屬離子的原子序號從小到大的變化,同樣會引起熒光強度減弱,磷光強度增強的現象,稱為“內部重原子效應”. 下表列出了8-羥基喹啉衍生物的金屬絡合物的熒光量子產率與中心金屬離子的原子序號的關系.原子序號增加,熒光強度降低,Tl則不產生熒光.b.內部重原子效應溶解在溶液中的氧往往會降低熒光體的熒光強度。特別是芳烴化合物如萘和

21、蒽等的熒光性會被氧猝滅.但是,對于不同的熒光體其影響程度是不同的.如沒有取代基的芳烴化合物,溶解氧的猝滅作用大,含取代基芳烴或雜環化合物,氧分子幾乎沒有猝滅作用.有人認為可能是由于三重態的氧分子和激發單重態的熒光物質分子相碰撞,形成了激發單重態的氧分子和三重態的熒光物質分子而引起的.也有人認為氧分子的順磁性增加了自旋軌道的相互作用,從而助長了系間交叉竄躍(S1 T1, T1 S1)（5）.溶解氧效應解釋溶劑的瑞利散射，容器表面的散射光和膠粒的散射光的波長與激發波長相同。散射光和拉曼光的影響1/ex-1/x=0.338x對應峰就是拉曼散射峰拉曼散射峰的位置隨激發波長的改變而變化,是可以預測和計算

22、出來的.Ru(phen)2(dppz)2+-DNA 的激發-發射光譜(ex=453nm). a.Ru(phen)2(dppz)2+溶液b. Ru(phen)2(dppz)2+-DNA溶液 453nm598nm535nm波數 波長的倒數,每厘米長度內含有 波長的數目,單位cm-1.波數的換算關系如右圖,哪一個發射峰為拉曼散射峰?/cm-1=1/(,cm)=104/(,m)1cm=104 m, 1 m=103nm453=453nm=0.453 m 598=598nm=0.598 m535=535nm=0.535 m1/453=1/0.453 m=2.2075m-11/598=1/0.598 m=1

23、.6722 m-1 1/535=1/0.535m=1.8692 m-1 1/ex- 1/598 =2.2075-1.6722=0.5353 m-1 1/ex- 1/535=2.2075-1.8692=0.3383 m-1 結論:535nm 處的發射峰為拉曼散射峰!1/ex-1/x=0.3381/x = 1/ex- 0.338x = 1/(1/ex- 0.338)注意! 1/ex和1/x的單位是m-1!如何得到拉曼散射峰?如果激發波長是480nm,拉曼散射峰是多少?x = 1/(1/ex- 0.338) =1/(1/0.48 -0.338) =1/(2.083 -0.338) =1/1.745 =0.573m =573nm結論:拉曼散射峰是573nm.如果激發波長是500nm,拉曼散射峰是多少?熒光儀器的主要組件1.激發光源： 常用的光源有氙燈和汞燈理想化的光源應具備：.足夠的強度.在紫外-可見光區級有連續的光譜.它的強度與波長無關，即光源的輸出應有連續平滑等強度的輻射。.光強要穩定2.單色器：濾光片，棱鏡或光柵3.檢測器：光電倍增管或光子計數器4.樣品池