1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2011年第39卷第3期一67一趙莉,鐘鳴,馬慧,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立J.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(3):6768,74農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立趙莉,鐘鳴,馬慧,李浩戈,陳麗靜,鐘聲(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)/遼寧省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,遼寧沈陽110161)染時間,共培養(yǎng)時間,不同濃度頭孢霉素,卡那霉素對農(nóng)桿菌的抑菌效果及其對煙草葉片分化的影響等進(jìn)行探索,建立了一種穩(wěn)定高效的煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系.關(guān)鍵詞:煙草;根癌農(nóng)桿菌;浸染;遺傳轉(zhuǎn)化中圖分類號:$572.032文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號:10021302(2011)0

2、3006702由于煙草的組織培養(yǎng)簡單,基因轉(zhuǎn)化效率較高等優(yōu)點,煙草成為植物基因工程和分子生物學(xué)研究中重要的模式植物.自從Horsh等首次獲得煙草轉(zhuǎn)基因植株以來,以煙草為材料的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為基因功能分析提供了有效途徑,因工程中,目前研究最清楚,應(yīng)用最廣泛的外源基因轉(zhuǎn)化方法是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),在已獲得的近200種轉(zhuǎn)基因植物中約有80%是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)完成的.因方法簡單,效率高,拷貝數(shù)少等優(yōu)點,它已成為目前主要的轉(zhuǎn)基因技術(shù).建立快速,高效,簡便的植株遺傳轉(zhuǎn)化體系對快速獲得轉(zhuǎn)基因植株至關(guān)重要.其中,外植體的選擇及其特定的生理狀態(tài),抗生素的篩選

3、,農(nóng)桿菌浸染濃度,浸染時間,外植體的暗培養(yǎng)時間等是植株遺傳轉(zhuǎn)化體植體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉圓盤法對煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,探索農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化條件及其影響因素,建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系,為目的基因功能的研究提供較好的基礎(chǔ).1材料與方法1.1.1植物材料以煙草品種中煙100為試驗材料,種子浸于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中30s,用無菌水沖洗,然后浸于0.1%氯化汞中4rain,濾出種子,再以無菌水清洗35次,用濾紙吸干.將消過毒的種子接種于播種培養(yǎng)基(1/2MS)中,于26光照條件下培養(yǎng),得到煙草無菌苗葉片.1.1.2菌株和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌為根癌農(nóng)桿菌EHA105,載體為pBI121,含卡那霉素篩

4、選抗性基因以及目的基因,利用液氮直接轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中.收稿日期:201l一01一l4基金項目:國家自然科學(xué)基金(編號:20977095,31070448);遼寧省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室專項基金.作者簡介:趙莉(1985一),女,河南鶴壁人,碩士研究生,主要從事mail:zhaozhao336163 .通信作者:鐘鳴,博士,副教授,主要從事植物生物技術(shù)的研究.Email:mingzhlsina.tom.體用無菌水沖洗45次,用濾紙吸干表面水分,再分別轉(zhuǎn)到附加不同質(zhì)量濃度(100,200,300,400,500,600mg/L)的頭孢篩選分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng).每處理30個外植體,3組重復(fù).

5、統(tǒng)計外植體污染率和抗性芽分化率,從而確定最合適的抗生素濃度.1.2.2外植體的選擇選取30,50,80,120d的煙草葉片,避開邊緣及主脈用打孑L器打成圓盤狀,再分別浸入農(nóng)桿菌菌液中進(jìn)行浸染,同時設(shè)置未浸染葉片為對照.草葉盤分別接種到含卡那霉素0,20,40,60,8O,100mg/L的MS培養(yǎng)基上,每處理接種3O個外植體,3組重復(fù),培養(yǎng)34周后統(tǒng)計外植體出芽率,從而確定卡那霉素的篩選濃度.1.2.4農(nóng)桿菌菌液浸染時間的確定將煙草葉盤分4組,每組30個外植體,設(shè)3組重復(fù).置于活化的農(nóng)桿菌(D為0.6)懸浮液中浸泡,間歇搖動,使葉片與菌液充分接觸,4組浸染時間分別為3,6,9,12min.浸染完

6、畢后取出葉盤,用無菌濾紙吸干表面菌液,轉(zhuǎn)入MS分化培養(yǎng)基中,暗培養(yǎng)2d,再轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng).草葉盤轉(zhuǎn)入MS分化培養(yǎng)基中,分別暗培養(yǎng)1,2,3,4d,然后轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng).每處理30個外植體,3組重復(fù).統(tǒng)計外植體抗性芽分化率,從而確定共培養(yǎng)時間.PCR鑒定因植株的DNA為模板,以含有目的基因片段的質(zhì)粒為陽性對照,以野生型植株作陰性對照,進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定.(2)RT的轉(zhuǎn)基因苗和野生型煙草幼嫩葉片的總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成eDNA,以目的基因的特異引物RTPCR分析目的基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況.2結(jié)果與分析由圖1統(tǒng)計得出,抗生素濃度對外植體分化具有明顯的影響.當(dāng)培養(yǎng)基中加入頭孢霉

7、素的濃度為400mg/L時,抗性一68一江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2011年第39卷第3期芽的分化率最高,達(dá)到31.1%;當(dāng)抗生素濃度過低而無法抑制農(nóng)桿菌的生長時,外植體污染導(dǎo)致死亡;當(dāng)抗生素濃度過高時,雖能有效抑制農(nóng)桿菌的生長,但是外植體嚴(yán)重白化,抗性芽的分化率低于10%.因此,抗生素的濃度定為400mg/L.至喜耄蠢0O8060402OO頭孢霉素的濃度(mg/L)圖1不同抗生素濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響30日齡的煙草剛長出45片小葉片,由于葉盤太幼嫩,在農(nóng)桿菌溶液中浸染容易染菌死亡;80日齡,120日齡的煙草葉片已經(jīng)變成深綠色,葉片比較大,雖然在后期浸染過程中抗菌能力較強,但是浸染效果差,影響轉(zhuǎn)化效率;對照組

8、中4個葉齡的葉片芽分化時間基本一樣.所以,在外植體的選擇上應(yīng)盡量選取50d左右的煙草葉片.在煙草轉(zhuǎn)化體系中,葉盤的分化能力可長達(dá)30d左右,每塊葉盤上分化的再生芽較多,對后期假陽性刪除難度增大.因此,該試驗在分化培養(yǎng)基中加入不同濃度的卡那霉素來確定適宜的選擇壓濃度,以便在早期獲得較高頻率的陽性植株.試驗結(jié)果(表1)表明,將未經(jīng)轉(zhuǎn)化的煙草外植體放在加有不同卡那霉素濃度的分化培養(yǎng)基上,分化受到不同程度的抑制.在060mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上能正常長出愈傷,分化出芽;濃度大于60mg/L的卡那霉素,分化受到不同程度的抑制;在100mg/L.卡那霉素的培養(yǎng)基中,葉片不能形成愈傷分化芽,逐漸發(fā)白死亡.

9、因此,本試驗選用100mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基作為外植體的卡那霉素篩選濃度.表1外植體對卡那霉素的敏感性分析由圖2看出,農(nóng)桿菌浸染時間對轉(zhuǎn)化效率的影響很大.農(nóng)桿菌浸染時間過短,農(nóng)桿菌無法有效附著,降低了共培養(yǎng)時農(nóng)桿菌的侵入,轉(zhuǎn)化效率降低;農(nóng)桿菌浸染時間過長,外植體5040潞3020敞lO驪0一_l36912浸染時間(rain)圖2不同浸染時間對轉(zhuǎn)化效率的影響受到農(nóng)桿菌傷害程度增大,抗性芽分化率較低.所以,浸染外植體菌液的D為0.6時,浸染時間確定為6min.共培養(yǎng)1d時,抗性分化率只有12.6%,外植體污染率也最低;當(dāng)共培養(yǎng)23d時,抗性芽分化率最高為31%,農(nóng)桿菌也能得到控制;而將共培養(yǎng)時間

10、延長到4d以上時,農(nóng)桿菌生長農(nóng)桿菌的適宜共培養(yǎng)時間確定為23d.由圖3可以看出,部分轉(zhuǎn)基因植株DNA擴(kuò)增出與質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物相同的特異性條帶,而陰性對照植株沒有擴(kuò)增植物初選的依據(jù),這只是在整合水平上進(jìn)行的檢測,有必要通過RTPCR檢測,在轉(zhuǎn)錄水平上為陽性的植株作進(jìn)一步驗證.由圖4可知,在被檢測的PCR陽性苗中,經(jīng)RTPCR擴(kuò)增均能產(chǎn)生與基因片段大小一致的特異電泳帶,而陰性苗生了mRNA.Ml2345672000bp一1000bpI一750bp-一MmakerDL2000;l一陽性對照;2野生型植株;基因植株提取DNA圖3轉(zhuǎn)基因煙草PCR鑒定結(jié)果Ml234562000bp.00bbpp一-37

11、轉(zhuǎn)MmakerDL2000;1一野生型植株;27轉(zhuǎn)基因植株提取DNA圖4轉(zhuǎn)基因煙草RTPCR鑒定結(jié)果3討論植物的遺傳轉(zhuǎn)化受到多種因素的影響,要想建立一個高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng),就必須對影響遺傳轉(zhuǎn)化的多體系的建立過程中,在轉(zhuǎn)化初期有效地篩選被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和化中使用的選擇性標(biāo)記基因有很多種,卡那霉素抗性基因是植物轉(zhuǎn)化中所用的第1個也是目前最常用的標(biāo)記基因u.但是不同品種的煙草對農(nóng)桿菌的浸染具有不同的敏感性,因此,確定受體植物合適的卡那霉素篩選濃度是十分必要的.本研究結(jié)果表明,卡那霉素濃度升至100mg/L時,中煙100的出愈率達(dá)到6.7%,大部分葉盤逐漸白化,繼而死亡,故適宜濃度為100mg/

12、L.外植體的選擇對轉(zhuǎn)化效率也有一定的影響,葉盤應(yīng)盡量取自幼嫩,健壯的葉片,這樣既易于誘導(dǎo)叢生芽,也不會由于多次操作和農(nóng)桿菌浸染而死亡,這與白林涵等的研究結(jié)果一(下轉(zhuǎn)第74頁)一74一江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2011年第39卷第3期進(jìn)呈快速增長趨勢,結(jié)莢期達(dá)到干物質(zhì)積累量高峰,為9951.O0kg/hrn2.春油菜的各個生育時期,對氮磷鉀肥的吸收量不同,春油菜需氮期主要在苗期,開花期和成熟期,苗期吸收的氮素為全生育期總吸收氮量的23.9l%,開花期為24.3%,成熟期為23.6%.磷,鉀養(yǎng)分開花期,成熟期吸收積累增加.因此根據(jù)油菜的需肥規(guī)律,前期注重施用氮肥,后期加強磷鉀肥施用.每生產(chǎn)100kg油菜籽粒吸收

13、氮7.98kg,磷1.22kg,鉀期氮磷鉀的積累與分配中心都為葉片,開花期為莖;結(jié)角期氮磷鉀的分配中心轉(zhuǎn)移到角果,此生長期鉀素還大量積累在莖中;成熟期氮和磷分配中心轉(zhuǎn)移到籽粒,鉀為莖稈.參考文獻(xiàn):對策J.青海農(nóng)林科技,2004(4):4143.2郝桂霞.青海省湟中縣旱作區(qū)油菜高產(chǎn)栽培技術(shù)J.甘肅農(nóng)業(yè)科技,2005(9):18.3趙霞,李發(fā)祥.青海省油菜籽市場競爭力的SWOT分析J.青海農(nóng)林科技,2005(1):4446,52.4朱艷,曹衛(wèi)星,沈維祥,等.油菜肥料運籌的動態(tài)知識模型J.生態(tài)學(xué)雜志,2005,24(2):209213.研究J.土壤肥料,2002(4):3537.(上接第68頁)最適

14、合浸染的時期,30日齡的煙草葉片雖然再生能力較強,但是對農(nóng)桿菌的耐受能力太差,所以50日齡的煙草葉片最適合用于轉(zhuǎn)化.植物材料受到農(nóng)桿菌浸染后須用抗生素及時,有效地殺死或抑制細(xì)菌,以防止細(xì)菌危害組織并影響植株再生;但同時向培養(yǎng)基中加入抗生素也會影響植物組織的正常生長和分化,所以,確定合適的抗生素使用量對提高遺傳轉(zhuǎn)化效率具有重要意義.在本試驗過程中,為抑制農(nóng)桿菌的過度繁殖,外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時培養(yǎng)基上覆蓋1層無菌濾紙,共培養(yǎng)結(jié)束后,用含有頭孢霉素(400mg/L)的無菌水浸泡,再沖洗67次,然后用濾紙吸干水分,后期結(jié)果表明此做法具有一定的抑菌效果.綜上所述,本研究建立了煙草的高效轉(zhuǎn)化體系,經(jīng)PC

15、R和RTPCR檢測證明,外源基因已初步整合到煙草基因組中,并能夠在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá).參考文獻(xiàn):研究J.西北植物,2003,23(1):6O一63.2張寧,王蒂.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系研究J.甘肅農(nóng)業(yè)科技,2004(9):1113.0df0rtraIlsfrringgenesinnplantsJ.Science,1985,227(4691):1229一l231.4王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程原理與技術(shù)M.北京:科學(xué)出版社,2002.的研究J.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2001,24(1):2529.基因轉(zhuǎn)化體系的建立J.河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(5):2729,37.J.生物技術(shù),2005,15(6):5153.油菜的研究J.作物,2006,32(2):278282.9傅榮昭,孫勇如,賈士榮,等.植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)手冊M.北京:中國科學(xué)技術(shù)出