1、97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 分子生物學綜合實驗論文分子生物學綜合實驗論文題 目: 綠色熒光蛋白(GFP)的基因克隆及表達 中國黃石2010 年 12 月 綠色熒光蛋白（綠色熒光蛋白（GFPGFP）基因的克隆與表達）基因的克隆與表達胡麗丹（湖北師范學院生命科學院 0803 班 湖北 黃石 43500）97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf I摘要：綠色熒光蛋白（GFP）是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內的生物發光蛋白。用堿裂解法提取的的質粒 pEGFP-N3 和 pET-28 經過BamH I 和 Not

2、 I 雙酶切連接后，得到 pET-28-pEGFP-N3 重組質粒。取部分的重組質粒做酶切實驗，驗證重組質粒的存在性，剩下的重組質粒導入表達菌 E. coLi BL-21 大腸桿菌感受態細胞中。重組有 GFP 基因的 E. coLi BL-21，在含有 1 L/mL 的卡納霉素的 LB 培養基上培養。當 A600達到 0.7 時，用終濃度為 0.8 mM 的異丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）誘導培養 3 小時，離心得到下層綠藍色沉淀物即可。關鍵詞：綠色熒光蛋白 GFP 基因的克隆 熒光蛋白 水母CLoning and Expression of Green FLuorescent Prote

3、in GeneHU Li-Dan( Class three Grade eight, College of Life Sciences department, Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abstract：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins 97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf II,has been found existing in the internal of Coelenterates,such

4、as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28 was harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with BamH I and Not I, the recombinant plasmid,namely pET-28-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Aga

5、rose Gel Electrophoresis.Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(BamH I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21 the competent cells. E. coLi BL-21 containing recombinant GFP gene was grown overnight in

6、LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 L/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL -D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.Key words: Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin 目錄目錄1.1.前言：前言

7、：.11.1 綠色熒光蛋白（GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP）.11.1.1 GFP 研究背景.11.1.2 GFP 研究應用.21.2 基因的克隆與表達 .397ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf III2.2.實驗試劑及實驗儀器：實驗試劑及實驗儀器：.52.1 實驗試劑與材料： .62.2 實驗儀器： .73.3.實驗方法實驗方法.73.1 質粒提取方法: .73.2 瓊脂糖凝膠電泳及回收: .93.3 酶切及連接： .113.4E. COLI DH5或E. COLI BL21 感受態制備及轉入： .123.5 酶切驗證重組質粒：

8、 .133.6GFP 基因的表達 .143.6.1 活化菌種.143.6.2 擴大培養.143.6.3 IPTG 誘導 GFP 基因的表達.144.4.結果與分析結果與分析.144.1 質粒提取過程中現象與結果： .144.2 瓊脂糖凝膠電泳 .154.3E. COLI DH5或E. COLI BL21 感受態制備及轉入結果 ： .164.4 酶切驗證重組質粒 .164.5 GFP 基因的表達結果：.175.5.討論：討論：.185.1 提取質粒出現圖六的原因是： .185.2 瓊脂糖凝膠電泳出現圖七、圖八原因： .185.3 E. COLI DH5或E. COLI BL21 感受態制備及轉入

9、出現圖九、十原因: .195.4 酶切驗證重組質粒出現圖十一原因： .195.5 GFP 基因的表達結果如圖十二、十三原因：.196.6.參考文獻參考文獻.2097ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 0前言：1.1 綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）1.1.1 GFP 研究背景綠色熒光蛋白是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內的生物發光蛋白。當受到紫外或藍光激發時，GFP 發射綠色熒光1。日本科學家下村修 1962 年第一次從一種水母中發現了綠色熒光蛋白, 如圖一所示。 這種蛋白在紫外線光中呈現綠色, 這種水母體

10、內含有一種生物發光蛋白質aequorin，但它本身發藍光,通過對光譜的研究, 下村修提出了發光景水母所發的綠光是因激發的水母素向綠色熒光蛋白發生的熒光能量轉移所致。即水母素作為一種能量供體, 而綠色熒光蛋白成為能量受體。水母素和綠色熒光蛋白都有重要的應用, 但水母素是熒光酶的一種, 它需要有熒光素底物, 經過酶促反應后發光。GFP 能把這種光轉變成綠色，也就是當水母容光煥發的時候我們實際看到的顏色。其在陽光下呈綠色、 鎢絲下呈黃色、 紫外光下呈現強烈綠色2。1987 年，道格拉斯普萊沙（Douglas Prasher）克隆出了 GFP 的基因序列。1993 年，在普萊沙的基礎上，馬丁沙爾菲（M

11、artin Chalfie）成功地通過基因重組的方法使得除水母以外的其他生物（如大腸桿菌等）也能產生 GFP，這不僅證實了 GFP 與活體生物的相容性，還建立了利用 GFP 研究基因表達的基本方法，而許多現代重大疾病都與基因表達的異常有關。至此，生物醫學研究的一場“綠色革命”揭開了序幕。此后，謝爾蓋路基亞諾夫（Sergey A. Lukyanov）又從一種珊瑚中分離出了與綠熒光蛋白類似，但能發出紅色光的熒光蛋白，預示著熒光蛋白可以有不同的顏色。美籍華人錢永健（Roger Y. Tsien）系統地研究了綠熒光蛋白的工作原理， 。錢永健還對綠色熒光蛋白進行了顏色突變。不同顏色可以同時在同一個圖一：

12、夜晚水母體內 GFP 顯色4 Figure1 Chromogenic GFP in Fellyfish at night4 97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 1細胞或組織內標記多種蛋白或結構。多種顏色的綠色熒光蛋白的出現, 為研究蛋白之間的相互作用、蛋白分解等提供了無限的可能性。現在世界各地實驗室使用的 GFP , 都是經過改造優化了的, 而錢永健是這方面的先驅和領先人物2。1996 年 GFP 的晶體結構被解出，蛋白質中央是一個圓柱形水桶樣結構，如圖二. 長 420 nm，寬 240 nm，由 11 個圍繞中心 螺旋的反平行 折疊組成，熒光基團的形成就

13、是從這個螺旋開始的，桶的頂部由 3 個短的垂直片段覆蓋，底部由一個短的垂直片段覆蓋，對熒光活性很重要的生色團則位于大空腔內。發色團是由其蛋白質內部第 65-67 位的 Ser-Tyr-GLy 自身環化和氧化形成2。圖二：GFP 晶體結構 圖三: 質粒 pEGFP-N35Figure2 Crystal structure of GFP Figure3 pEGFP-N352001 年 1 月 11 日，美國科學家宣布培育成世界上首只轉基因猴, 這是世界上首次培育成功轉基因靈長類動物. 添加在這只名為安迪的猴子體內的就是這種標志基因。1.1.2 GFP 研究應用研究應用在生物學研究中，科學家們更多的

14、是利用這種能自己發光的熒光分子來作為生物體的標記。將這種熒光分子通過化學方法掛在其他不可見的分子上，原97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 1來不可見的部分就變得可見了。生物學家一直利用這種標記方法，把原本透明的細胞或細胞器從黑暗的顯微鏡視場中“糾出來”。但傳統的熒光標記在發光的同時，會產生具有毒性的氧自由基，導至被觀察的細胞死亡，這叫做“光毒性”。因此，在 GFP 發現以前，科學家們只能通過熒光標記來研究死亡細胞靜態結構。相反，綠色熒光蛋白對生物體無毒無害, 分子量小, 方便構建載體, 同時在多種非水母的生物體中均可穩定表達并易于檢測, 所以, 作為一種生

15、物分子標記, 具有廣泛的應用前景 3。由于 GFP 熒光是生物細胞的自主功能, 是一種現成的熒光蛋白質，熒光的產生不需要任何外源反應底物,因此 GFP 作為一種廣泛應用的活體報告蛋白,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。本實驗是利用實驗室提供的質粒 pEGFP-N3,其結構如圖三所示.其上有所用酶的酶切位點。1.2 基因的克隆與表達 基因克隆（分子克隆 molecular cloning）-通過體外重組技術,將一段目的DNA 經切割、連接插入適當載體，并導入受體細胞，擴增形成大量子代分子的過程。如下圖四所示:所需元件:限制性內切酶: BamH I 和 Not I（BamH I 的切點為：5

16、-GGACC-3 Not I 的切點為 5-GCGGCCGC-33-CCTAGG-5 3-CGCCGGCG-5載體: E. coLi DH5a（1.易于接納外源 DNA。 2.無特異的內源性核酸內切酶 3.載體復制、擴增不受阻 4.與質粒有互補性)受體細胞: E. coLi BL-21（1.易于接納外源 DNA。 2.無特異的內源性核酸內切酶 3.載體復制、擴增不受阻 4.與載體有互補性）目的基因: pEGFP-N3選擇標記基因：pET-28（同時含有抗 kana 的基因有助于后面選擇，和 -半乳糖苷酶基因可被異丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）誘導表達目的基因 GFP）連接：平末端連接（相同

17、酶切產生互補的粘性末端，再通過堿基互補配對連接）97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 2 原核基因表達系統（Gene Expression）： 由于目前對原核生物基因結構了解的要透徹一些，所以一般將目的基因導入到原核生物中。將外源基因引入原核細胞，并使其在原核細胞中以發酵形式快速高效地表達、合成基因產物的體系。如圖五所示。為提高 GFP 表達的效率，我們一般可從以下三個方面考慮：1.基因水平上:盡量選用受體細菌細胞的偏愛性密碼子62.載體水平上:通過核外質粒構建合適的操縱子、增強子6,如本實驗的 -半乳糖苷酶操縱子基因,故通過異丙基硫代-D-半乳糖苷（IPT

18、G）誘導表達目的基因GFP 表達3.作為受體細胞上:根據 DH5a 和 E. coLi BL-21 結構特點不同,前者對外援質粒擴增阻礙作用很小,故作為克隆菌;后者易于外源基因表達,故選用表達菌。圖四：基因克隆的過程Figure4 Process of gene cloning97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 3本實驗是應用已學過的分子知識和查閱一些參考文獻，來設計老師給定的實驗課題。第一，是學習運用科學理論知識指導設計實驗使用方法；第二，學習科學嚴謹的實驗操作；第三，查閱文獻了解并學習了綠色熒光蛋白基因（GFP）相關特性和研究進展，鞏固理論知識的同時也

19、開拓了我們的視野。本實驗我們做了以下工作：將綠色熒光蛋白基因（GFP）插入 pET-28 構建 pET-28- pEGFP-N3 重組質粒，將重組質粒導入 E. coLi DH5 擴增，用堿法提取質粒。核酸電泳檢測質粒是否成功導入大腸桿菌，再酶切鑒定所提取質粒是否為重組質粒。將提取的質粒導入 E. coLi BL-21 感受態中，經 IPTG 誘導目的基因表達產生綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein,GFP ） 。本試驗通過做實驗過程中，王老師細心地指導及斧正以及同組同學的協商配合，最終實驗結果大抵讓人滿意。在表達菌 E. coLi BL-21 中表達了我們期望的結

20、果綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein,GFP ） 。但此試驗在 LB 培養基平板上生長效果不是很好，酶切效果也不是那樣完美，在以后的實驗設計中要進一步完善這兩部分的工作。2.實驗試劑及實驗儀器：圖五：基因克隆與表達Figure5 Gene cloning & expression97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 42.1 實驗試劑與材料：1.克隆菌株 EcoLi DH5(8311 實驗室提供)2.表達菌株 EcoLi BL21(8311 實驗室提供)3.LB 培養基：10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g

21、氯化鈉，溶于 950 mL 中，用 NaOH 調節 pH 至 7.0，補加蒸餾水至總體積為 1 L，分裝后高壓蒸汽滅菌。（對于固體培養基加入 10-15 g 瓊脂粉后再加熱滅菌）4.溶液: 50 mM 葡萄糖，25 mM Tris-HCL(pH 8.0)，10 mM EDTA(pH 8.0） 。1 M Tris-HCL(pH 8.0）12.5 mL，0.5 M EDTA（pH 8.0）10 mL，葡萄糖 4.730 g，加 ddH2O 至 500 mL。在 10 Lbf/in2 高壓滅菌 15 min ，貯存于 4 。5.溶液：0.2 M NaOH，1% SDS。2 M NaOH 1 mL，1

22、0%SDS 1 mL，加 ddH2O至 10 mL。使用前臨時配置。6.溶液：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300 mL，冰醋酸 57.5 mL，加 ddH2O 至 500 mL。4 保存備用。7.TE：10mM Tris-HCL(pH 8.0)，1 mM EDTA(pH 8.0)。1 M Tris-HCL（pH 8.0）1 mL，0.5 M EDTA（pH 8.0）0.2 mL，加 ddH2O 至 100 mL。15 Lbf/in2 高壓濕熱滅菌 20 min，4 保存備用。8.氯仿（1:1）9.乙醇（無水乙醇、70%乙醇）10.50TAE：Tris 堿 54 g，硼酸

23、 27.5 g，EDTA-Na22H2O 4.65 g，加 ddH2O 至1000 mL。15 Lbf/in2 高壓濕熱滅菌 20 min，4 保存備用。11.溴化乙錠（EB）：10 mg/mL12.RNase A（RNA 酶 A）：不含 DNA 酶(DNase-free) RNase A 的 10 mg/mL，TE 配制，沸水加熱 15 min，分裝后貯存于-20。13. 6Loading buffer（上樣緩沖液）：0.25% 溴酚藍，0.25% 二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。14.0.8% 瓊脂糖凝膠：稱取 0.4 g 瓊脂糖于三角燒瓶中，加 50 mL 1TAE，電熱套加熱

24、至完全溶化，冷卻至 60 左右，輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻 30 min 以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 5泳緩沖液 1TAE） ，即可上樣。15.雙酶切體系：DNA sampLe 8 L, BamHI 0.5mL（大連寶生物公司提供）, Not I 0.5mL（大連寶生物公司提供）,BufferH 2 mL,Triox-100(0.1%) 1uL,BSA(0.1%) 1 L, ddH2O 6 L16.10Buffer H：100 mM Tris-HCL PH7.5,100 mM M

25、gCL2,10 mM Dithiothreiol500 mM NaCL17.0.1 M CacL218.IPTG，kana 固體粉末2.2 實驗儀器：ORION pH 計（上海公司）,HD-3 紫外檢測儀（日本有限公司）GL-2M 型冷凍離心機（湖南星科儀器有限公司）雪山制冰機（北京長洋科學儀器公司）超純水機 AYJ1-0501-U（頤洋企業發展有限公司）電泳儀 DYY-5（北京市六一儀器廠）電子天平 TE412-L，TE2101-L，CP64（德國 Satorins 公司）BS-1E 振蕩培養箱(江蘇省金壇市億通電子儀器廠)高壓滅菌鍋 YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司） ，手持式紫外燈

26、雙面紫外超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）,電熱套3.實驗方法3.1 質粒提取方法:方法分別有以下幾種：堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法，質粒 DNA釋放法；酸酚法等。概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理。所有分離質粒 DNA 的方法都包括 3 個基本步驟：培養細菌使質粒擴增；收集和裂解細菌；分離質粒 DNA(有時還要求純化質粒DNA，根據實驗所需) 選擇哪一種方法主要取決于以下幾個因素：質粒的大小、大腸桿菌菌株、97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 6裂解后用于純化的技術和實驗要求。對于本實驗要求提出大量的質粒，且

27、為使操作簡便故選用 SDS 堿裂解法。其基本原理：（1）當菌體在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解時，蛋白質與 DNA 發生變性，當加入中和液后，質粒 DNA 分子能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時留在上清中；蛋白質與染色體 DNA 不復性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。（2）在一定電場強度下，DNA 分子的遷移取決于分子篩效應，即 DNA 分子本身的大小和構型(相對分子質量不同的 DNA 片段泳動速度不一樣)，且 DNA 分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關系。因此，凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質量的 DNA，也可以分離相對分子質量相同，但構型不同的DNA 分子：其中超螺旋結構泳動最快，

28、其次為線性結構，最慢的可能是復制中間體（沒有復制完的兩個質粒連在一起） ，而不是開環結構（用 EcoRI 來線性化質粒后再進行瓊脂糖電泳，就會看到線性質粒 DNA 的位置與這三條帶的位置不一樣）其具體操作步驟如下：1. 挑取 LB 固體培養基上生長的單菌落，接種于 20 mL LB（含 Kana1L /mL）液體培養基中，37 、200rmp 振蕩培養過夜（約 14h）。2. 取 1.5mL 培養液倒入 1.5 mL eppendorf 管中，10000rmp 離心 1min。棄上清，將離心管倒置于衛生紙上，使液體盡可能流盡。3、菌體沉淀重懸浮于 200 L 溶液中, (需劇烈振蕩，使菌體分散

29、混勻。)室溫下放置 3 min。4、加入新配制的溶液300 L，蓋緊管口，快速溫和顛倒 eppendorf 管數次，以混勻內容物(千萬不要振蕩)，冰浴 3 min。5、加入 200 L 預冷的溶液，蓋緊管口，將管溫和顛倒數次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置 3min。 12000rmp 離心 3min。溶液為中和溶液，此時質粒 DNA 復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時 K+使SDS-蛋白復合物沉淀。6、上清液 500 L 移入干凈 eppendorf 管中，加入等體積的酚/氯仿，振蕩混勻, 12000rmp 離心 10min。（500 L 的苯酚/氯仿/異戊醇。）97e

30、be7db94898976a5371638e901835b.pdf 77、小心移出上清于一新微量離心管中，加入 2 倍體積預冷的無水乙醇，混勻，室溫放置 2-5min，離心 10000rmp2min。8、棄上清，將管口敞開倒置于衛生紙上使所有液體流出，加入 1mL 70乙醇洗沉淀一次，10000rmp 離心 10 min。9、 吸除上清液，將管倒置于衛生紙上使液體流盡，室溫干燥。10、將沉淀溶于 20 L TE 緩沖液(pH8.0 儲于-20冰箱中。)3.2 瓊脂糖凝膠電泳及回收:實驗原理：瓊脂糖凝膠電泳的原理概述 瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結構單元是 d-半乳糖和 3，6-脫水-L

31、-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網孔型凝膠。影響 DNA 在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素主要有：（1）DNA 分子的大小 雙鏈 DNA 分子在凝膠基質中遷移的速率與其堿基對數的常用對數成反比。分子越大，遷移的越慢，因為摩擦阻力越大，也因為大分子通過凝膠孔徑的效率低于較小的分子。（2）瓊脂糖濃度 給定大小的線狀 DNA 片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中遷移速率不同。在 DNA 電泳遷移速率的對數和凝膠濃度之間存在線性相關。 （3）DNA 的構象 超螺旋環狀（型） 、切口環狀（型）和線狀（型）DNA 在瓊脂糖凝膠中以不同速率遷移。其相對遷移速率主要取決于瓊脂

32、糖凝膠的濃度和類型，其次是電流強度、緩沖液離子強度和型超螺旋絞緊的程度或密度。一些條件下，型 DNA 比型遷移得快；在另一些條件下，順序可能相反。（4）所用的電壓 低電壓時，DNA 片段遷移率與所用的電壓成正比。電場強度升高時，高分子量片段的遷移率遂不成比例的增加。所以，當電壓增大時瓊脂糖凝膠分離的有效范圍反而減小。要獲得大于 2kb DNA 片段的良好分辨率，所用電壓不應高于 5-8V/cm。 （5）電泳緩沖液 DNA 的泳動受電泳緩沖液的組成和離子強度的影響。缺乏離子則電導率降低，DNA 或者不動或者遷移很慢。高離子強度時（如 10buffer） ，電導率升高，使得應用適中的電壓也會產生大

33、量的熱能，最嚴重時凝膠會熔化，DNA 變性。具體操作步驟：97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 81.1.0.8%瓊脂糖凝膠的配制：精確稱取 0.4 g 瓊脂糖加到三角瓶中，加 50 mL 1TAE 緩沖液于三角瓶中，于微波爐中加熱至完全熔化，冷卻至 60 左右，2.用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；3.輕輕旋轉瓊脂糖凝膠以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；4.室溫下 45 分鐘后凝膠完全凝結，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內；5.向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面 1mm 為宜，如樣品孔內有氣泡，應設

34、法除去；6.在 DNA 樣品中加入 10體積的載樣緩沖液（Loading buffer） ，混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內；7.接通電源，紅色為正極，黑色為負極，切記 DNA 樣品由負極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負)。一般 100V 電壓，電泳 40min 即可；8.根據指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；9.電泳完畢，關上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準 Marker 比較被擴增產物的大小。 10. 同原質粒一起瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收片段。根據亮度可以估計回收的量。11. 待回收的 DNA 段經電泳分離后，從瓊脂糖凝膠上切下所需 DNA

35、段，放在1.5 mL EP 管中；12. 加入 3 倍（請準確估量凝膠的體積）體積的溶膠液（以 100 L 體積膠加入 300 L 溶膠液為一次標準反應） ，室溫下放置 5 分鐘或 50 保溫 3 分鐘，其間輕搖 EP 管幾次使膠完全融化；13. 加入 10 L 玻璃奶（玻璃奶使用前請充分搖勻） ，顛倒混勻，冰浴下放置 10分鐘。每隔 23 分鐘混勻一次，12000rpm 離心 30 秒，吸棄上清；14. 加 250 L 漂洗液（濃縮漂洗液使用前，按濃縮漂洗液：無水乙醇= 3：7 配制成工作濃度） ，用加樣器吹打漂洗液，輕柔地將玻璃奶懸浮混勻，12000rpm 離心 30 秒，吸棄上清；15.

36、 重復步驟 4（盡量吸盡漂洗液） 。吸取完漂洗液后再離心 10 秒鐘，用 Tip 頭97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 9將最后一點兒漂洗液吸干凈。然后，放置于 37烘箱干燥直至沉淀呈白色，約 1520 分鐘；16. 加適量洗脫緩沖液即無菌水（20 L 為一次標準反應） ，混勻，60 水浴 5分鐘，12000rpm 離心 1 分鐘，回收上清備用。重復步驟 6，能提高回收率。3.3 酶切及連接酶切及連接：實驗原理：迄今已發現了 3000 多種限制性內切酶。傳統上將限制性內切酶按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等因素劃分為三大類。II 型酶在其識別位點

37、之中或臨近的確定位點特異地切開 DNA 鏈。它們產生確定的限制片段，因此是三類限制性內切酶中唯一用于 DNA 分析和克隆的一類。II 型限制性內切酶中最普遍的是象 EcoR I、Hind III、BamH I和Not I 這樣在識別序列中進行切割的酶。這一類酶是構成商業化酶的主要部分。大部分這類酶都以同二聚體的形式結合到 DNA 上，因而識別的是對稱序列；但有極少的酶作為單聚體結合到 DNA 上，識別非對稱序列。一些酶識別連續的序列（如EcoR I 識別 GAATTC；Hind III 識別 AAGCTT;Bam HI 識別 GGATCC; Not I 識別 GCGGCCGC） ；而另一些識別

38、不連續的序列（如 BgL I 識別GCCNNNNNGGC） 。限制性內切酶酶切 DNA 后形成兩種類型的末端：(i)兩條鏈斷裂的位置是交錯地，產生粘性末端，如 EcoR I 酶切后產生末端；(ii)兩條鏈的斷裂位置處在一個對稱結構的中心，產生平末端，如 Hae III 酶切后產生 DNA 連接酶能夠催化在兩條 DNA 鏈之間形成磷酸二酯鍵，這種酶需要在一條DNA 鏈的 3-末端具有一個游離的羥基（-OH） ，和在另一條 DNA 鏈的 5-末端具有一個磷酸基團（-P） 。 5-GAATTC-33-CTTAAG-55-GGCC-33-CCGG-5 。Ligase535397ebe7db948989

39、76a5371638e901835b.pdf 10 反應體系選平衡液，依據查閱內切酶供應商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同 buffer 中的活力表，如果有一種 buffer 能同時使 2 種酶的活力都超過 70%的話，就可以用這種 buffer 作為反應 buffer。對于本實驗所用的酶為 BamH I 和Not I 在 bufferH 均有最高酶活性。 具體操作步驟：按如下雙酶切體系（30 L）混合 ：反應物（L）pEGFP-N3 pET-28a質粒 1818 BamH I 2 2 Not I 2 2 10bufferH3 3 0.1%BSA 緩沖液 3 3 1.離心 10s，混勻。2.

40、37水浴酶切 3h。3.配制 1.0%（M/V）普通瓊脂糖凝膠 30mL。4.適當放置冷卻，45左右倒于電泳膠板上，插好梳子。5.待凝膠凝固好以后，撥下梳子。6.酶切樣品中加入 5 L 溴酚藍-GeneFinder 混合液混勻，上樣。7.在 1TAE Buffer，80V(3-4V/cm)下電泳 30min8.回收連接好的目的基因，依次加入 5 L 回收純化的 pET-28a 質粒,GFP 基因片段 12 L，T4 連接酶 1L，緩沖液（10）2 L3.4E. coLi DH5 或 E. coLi BL21 感受態制備及轉入：實驗原理:感受態就是細菌吸收轉化因子的生理狀態，只有發展為感受態的細

41、胞才能穩定攝取外來的 DNA 分子。受體細胞經過一些特殊方法（如：電擊法，CaCL2等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許帶有外源 DNA 的載體分子進入的感受態細胞。目前常用的感受態細胞制備方法有 CaCL2 法，簡便易行，且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態細胞暫時不用時，可加入占總體97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 11積 15的無菌甘油于-70保存(半年)，因此 CaCL2法為使用更廣泛。將正在生長的大腸桿菌細胞在 0下加入到低滲的 CaCL2溶液中，便會使細胞膜的透性發生改變，此時的細胞即呈現為感受態。這一

42、方法可以用于批量制備感受態細胞，其轉化效率可達到 5106-2107個轉化克隆子/g 超螺旋質粒DNA。制備好的大腸桿菌感受態細胞可在-70凍存。在 0下外源 DNA 可吸附到感受態細胞表面，短時間的熱刺激（42，90s）誘導細胞吸收 DNA。 轉化了質粒DNA的大腸桿菌隨后在培養基中37培養1h，可使質粒DNA中編碼抗生素抗性的基因得以表達，因此，轉化了質粒DNA的大腸桿菌細胞可在含有相應抗生素的培養基上生長，而沒有轉化的細胞則無法生長。具體實驗操作步驟：用槍頭挑一大腸桿菌E.coLi DH5或BL21單菌落放入2 mL LB液體培養基（含Kana 1 L/mL），37 培養過夜。（1） 活

43、化大腸桿菌：取4mL新鮮的LB液體培養基加入80 L的過夜菌，培養3個小時。（2） 將昨夜搖出來的E.coLi DH5或BL21培養液轉入離心管中,冰上放置10min,然后于4 下4000rpm離心5min。 （3） 棄去上清,用預冷的0.1mol/L 的CaCL2溶液600L輕輕懸浮細胞,冰上放置20 min, 4下4000rpm離心5min。 （4） 棄去上清,加入300 L預冷的0.1mol/L的CaCL2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置5min,即成感受態細胞懸液，可-80長期保存。（6） 取2個無菌離心管，分別加入100 LDH5感受態細胞懸液，第1管加5 L無菌水，第2管加入質粒DN

44、A溶液5 L,輕輕搖勻,冰上放置30min。（7） 42水浴中熱激90s,熱激后迅速置于冰上冷卻5min。 （8） 分別向管中加入400 L LB液體培養基,混勻后在37振蕩培養60min。 （9） 從管1中取100 L涂布于含抗生素,從管2中取100 L涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置約10分鐘,待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿,37培養14小時。3.5 酶切驗證重組質粒：97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 12原理：經同種酶切后（BamH I 和 Not I） ，重組質粒從新被切開，經瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外分析儀下看其跑過的膠圖，進行分析。實驗

45、步驟：按如下雙酶切體系（20 L）混合 ：提取 E.coLi DH5 中的重組質粒，在下列體系下反應 反應物（L）pET-28-pEGFP-N3質粒8BamH I500Not I50010bufferH20000.1%BSA 緩沖液3Triox-100(0.1%) 1BSA(0.1%) 1ddH2O6水浴 2h 后，經過瓊脂糖凝膠電泳。3.6GFP 基因的表達3.6.1 活化菌種用黃色槍頭蘸取表達菌 E.coLi BL21 種單菌落，連同槍頭一起垂直放入裝有 2 mL 的 LB 液體培養基的試管（含有卡那青霉素，其工作濃度為 1L /mL）中。于 37 搖床振蕩培養 14 小時。 3.6.2

46、擴大培養 將試管中活化的 80L 菌液接種到 4 mL LB 培養基，同時加入卡那青霉素（終濃度 1L /mL）培養基于 37 恒溫培養箱中培養 3 小時。3.6.3 IPTG 誘導 GFP 基因的表達實驗中在不同的培養時間（用 OD 值表征菌體密度）加入 IPTG 誘導表達發現，當 OD=0.8 時，加的 IPTG 至終濃度為 0.8mM 時 GFP 的表達量達到最大97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 134.結果與分析4.1 質粒提取過程中現象與結果：階段溶 液 I溶 液溶 液:氯 仿現 象EP 管中溶液為混濁液。EP 管中出現上層變澄清，下層沉淀EP

47、 管中溶液溶液有絮狀物產生加入氯仿離心后溶液分層圖表六 3-1 堿法提質粒過程中的現象 Figure6 sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction結果分析:加入溶液的作用是維持細胞滲透壓，使細胞懸浮在溶液中，故呈現渾濁；加入溶液作用使細胞裂解，釋放內涵物，內含物溶于溶液，故上層變澄清；加入溶液作用是時變性的質粒在酸鹽環境下從新復性，但大量基因組 DNA不能復性，在 PDS 作用下產生絮狀沉淀。加入氯仿破壞了蛋白質，使其變性沉淀。4.2 瓊脂糖凝膠電泳如圖七所示電泳結果圖可以看到，第一孔道和第九孔道跑的帶在紫外分析儀下,明顯跑帶量

48、少,效果不如其余七條帶。中間幾條帶總共出現五條帶如圖八，條帶 1 最為明亮，說明第一條帶出所含的核酸物質最多。大腸桿菌中 RNA 的拷貝數遠大于質粒 DNA 的拷貝數，而核酸電泳分析過程的實驗操作過程中沒有加入 RNase 降解所制樣品中含有較多的 RNA，所以判斷該條帶一定為 RNA。提取的質粒多數以超螺旋型存在，超螺旋的質粒 DNA 中一個螺旋由 10 個堿基組成，當分子上有一個缺刻時，分子會立即松弛，形成開環分子。如果質粒的雙鏈配對處都斷裂則形成線性質粒。分子量相同的情況下，可以判定：條帶 2為超螺旋 DNA，條帶 3 為線性 DNA，條帶 4 為開環 DNA，條帶 5 可能為線性DNA

49、，超螺旋 DNA，開環 DNA 中的兩者或是三者纏在一起未得到分離。97ebe7db94898976a5371638e901835b.pdf 0 圖七：瓊脂糖凝膠電泳九條孔道電泳Figure7 All channels in Agarose Gel El ectrophoresis圖八：瓊脂糖凝膠電泳中間七條孔道電泳圖Figure8 Seven channels amid Agarose Gel Electrophoresis4.3E. coLi DH5 或 E. coLi BL21 感受態制備及轉入結果 ：管 1 中取 100 L 無菌水涂布于含抗生素 LB 平板結果如圖九為：LB 平板未生

50、長任何菌落;管 2 中取 100 L 重組質粒涂布于含抗生素的平板上結果如圖十為：生長少量菌落;分析：管 1 做空白對照，表明在含抗生素的培養基上無法生存任何自然條件菌落；管 2 實驗組，表明重組質粒能表達某種蛋白物質，使重組均在此環境能生存。圖九：空白對照管 1Figure 9 Negative contrast 圖十：實驗組管 2 Figure 10 Experimental group4.4 酶切驗證重組質粒如圖十一所示所有孔道，其中第七八孔道是濃度不同的 Maker 蛋白。其余九條孔道為實驗酶切的帶。兩條 Maker 蛋白明顯可見六條帶，而實驗組的帶型都很綠色熒光蛋白（GFP）基因的克

51、隆與表達 1模糊。已知 pEGFP-N3 的分子量為 4700bp,而 pET-28a 分子量為 5369 bp，故在相同的構型下，pEGFP-N3 應比 pET-28a 跑的快一些。圖中所示的六條帶，有上述原理可以判斷為：條帶 1 pEGFP-N3 超螺旋 DNA，條帶 6pET-28 開環DNA，剩下帶 2、3、4、5 難以準確判斷，但線性 pEGFP-N3 肯定在環形 pEGFP-N3 之前，超螺旋 pET-28 也肯定在線性 pET-28 之前的。圖十一：酶切驗證質粒 Figure11 Validate plasmid via enzyme-cutting4.5 GFP 基因的表達結果

52、：加入 IPTG 誘導后，可觀察到菌體細胞呈現綠色如圖十二所示，說明目的基因在表達菌 E. coLi BL21 中表達。如圖十三所示在紫外光下可以觀察到菌體細胞發綠色熒光。 圖十二：GFP 基因在表達菌內表達Figure12 GFP gene expression in E. coLi BL21綠色熒光蛋白（GFP）基因的克隆與表達 1 圖十三：GFP 在紫外光照射下Figure13 GFP exhibites green fluorescent under ultraviolet light5.討論：5.1 提取質粒出現圖六的原因是：1.加入溶液的作用是制備菌懸液，加入葡萄糖的作用是使懸浮后

53、的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部，所以觀察到得溶液呈乳白渾濁狀；2.加入溶液的作用是使細胞破裂，蛋白質和細胞壁沉淀，質粒溶出，NaOH 是最佳的溶解細胞的試劑，它使細胞膜發生了從 biLayer（雙層膜）結構向 miceLLe（微囊）結構的相變化導致細胞溶解，因此觀察到有大量白色絮狀沉淀；3.加入溶液的作用是使大腸桿菌基因組 DNA 沉淀，SDS 遇到鉀離子后變成 PDS，而 PDS 是水不溶的，基因組 DNA 較長因此發生了沉淀，因此觀察溶液較為澄清；4.氯仿為有機溶劑可以使蛋白質變性，進一步除去初提質粒中的蛋白質沉淀，氯仿不溶于水，所以觀察到分層現象5.2 瓊脂糖凝膠電泳出現圖七、圖八原

54、因：1.核酸電泳圖譜中凝膠的最前端條帶較亮，說明該處有較多的核酸物質，而在質粒提取分析過程的實驗操作過程中沒有加入 RNase 降解所制樣品中含有較多的 RNA（由 E. coLi DH5a 轉錄產生） ，所以判斷該條帶一定為RNA，但是由于電泳的時間不夠，導致不同大小的 RNA 未分開。2.第一孔道和第九孔道條帶沒有其他孔道的核酸物質得多，條帶不明顯。分析可能的原因是，第一孔道最先上樣，而總共有九個道操作時間過長導致開始電泳時孔道中的樣品已經發生擴散，所以導致電泳時條帶不明顯，而第九孔道上樣是樣品還未來得及在重力作用下進入孔道，電源就一接通，致使部分質粒樣品在緩沖液分子的作用下，擴散到緩沖液中，所以導致電綠色熒光蛋白（GFP）基因的克隆與表達 1泳時條帶不明顯3.第一孔道由于樣品時間放置過長后擴散，僅僅觀察 1 條帶，且為條帶 2，為超螺旋型質粒，因為一般提取的超螺旋質粒占總量的 70%以上，所以在樣品量較少的情況下僅可觀察到超螺旋質粒條帶。第九孔道由于樣品還未進孔道，在緩沖液的