1、542三±:i7“工5厶4i課題研習(xí)論文掠九生物糜進(jìn)旳頭效佳ux dna也雄取為例2012年12月 摘要：dna粗提取是屮學(xué)生物實驗屮的一個探究性實驗，木文通過講述前人的研究進(jìn)程， 包括肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗、噬菌體侵染實驗，引出dna是生物遺傳物質(zhì)，重點講述了 dna 粗提取的過程，以及在過程中的一些改進(jìn)，使得實驗課堂的時效性得以提高，同時采用小 組學(xué)習(xí)法提高課堂時效性。關(guān)鍵詞：dna；粗提取；時效性1前言32人類對dna的認(rèn)識過程32.1人類對遺傳物質(zhì)的探索過程32.2肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實驗42.3噬菌體的侵染實驗43dna粗提取及簡單染色53.1 dna粗提取的課堂實驗前準(zhǔn)備53.1

2、.1實驗材料5312用具53.1.3雞血細(xì)胞液制備53.1.4實驗原理63.2 dna粗提取的課堂實驗過程63.2.1破碎細(xì)胞，釋放dna63.2.2溶解細(xì)胞核內(nèi)的dna63.2.3 dna 的析出63.2.4 dna的初步純化73.3 dna粗提取的課堂實驗結(jié)果73.4 dna粗提取的課堂實驗的分析78889錯誤！未定義書簽。3.5粗提取的dna染色. 4rna的簡單介紹 5提高課堂時效性 6課堂時效性探究結(jié)論 參考文獻(xiàn)dna粗提取是中學(xué)生物實驗中的一個探究性實驗，實驗過程比較繁瑣，實驗現(xiàn)象難以 得出，容易失敗（同。通過學(xué)習(xí)前人對此實驗的做法，本次試驗采用雞血作為細(xì)胞材料，在 時間和用水上稍

3、作了修改，用以提高課堂的時效性。為了讓學(xué)生更易了解dna這種物質(zhì)， 課前進(jìn)行講述人類對遺傳物質(zhì)的探索過程、肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實驗和噬菌體侵染實驗，使 同學(xué)了解dna是什么，怎么來的，再通過做實驗讓學(xué)生知道dna并不神秘，它就在我們身 邊。實驗過程中采取分小組的形式進(jìn)行，在老師指導(dǎo)下合作學(xué)習(xí)，實驗步驟也稍稍做了修 改，以保證在一定時間內(nèi)完成這個實驗，提高課堂的時效性。2人類對dna的認(rèn)識過程2.1人類對遺傳物質(zhì)的探索過程最初在19世紀(jì)，孟徳爾提出遺傳因子概念，這也是遺傳學(xué)的起點。1903年，美國遺 傳學(xué)家薩頓觀察蝗蟲精子和卵細(xì)胞形成時，在顯微鏡卜-看到了孟徳爾所說的遺傳因子，確 實是成對存在的。1

4、909年摩爾根做的果蠅實驗證明了基因在染色體上。此時的人們還不知 道基因到底是怎樣一種物質(zhì)。直到1928年，格里菲思以小鼠為實驗材料做了著名的肺炎 雙球菌實驗，證明了遺傳物質(zhì)是dna。但是仍有相當(dāng)一部分人不相信dna是遺傳物質(zhì)。在 1931年，道森和西亞成功的在體外進(jìn)行了轉(zhuǎn)化實驗。1935年一1944年，經(jīng)歷了 10年不斷 的研究，美國洛克菲勒學(xué)院的三位免疫學(xué)家艾弗里，麥克勞德，麥卡提證明了 dna是肺炎 球菌的遺傳物質(zhì)。1952年,赫爾希和蔡斯做了噬菌體侵染細(xì)菌實驗，進(jìn)一步證明了 dna是 遺傳物質(zhì)。1953年，沃森與克里克發(fā)現(xiàn)了 dna的雙螺旋結(jié)構(gòu)。20世紀(jì)90年代，人類基因 工程計劃啟動

5、。格里菲斯的帥炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗、艾弗里證明dna是遺傳物質(zhì)的實驗、噬菌體侵染細(xì) 菌的實驗，既包含了科學(xué)家在研究過程中的創(chuàng)造性思維，將dna和蛋門質(zhì)分開研究，又反 映了科學(xué)家敢于質(zhì)疑，不斷探索的寶貴精神。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，今天的認(rèn)識和結(jié)論也 在不斷的修正發(fā)展z中。2.2肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實驗肺炎雙球菌是一種病原菌，存在著光滑型（簡稱s型）和粗糙型（簡稱r型）兩種 不同類型。其屮光滑型的菌株產(chǎn)生莢膜，有毒，在人體內(nèi)它導(dǎo)致帥炎，在小鼠體屮它 導(dǎo)致敗血癥，并使小鼠患病死亡，其菌落是光滑的；粗糙型的菌株不產(chǎn)生莢膜，無毒, 在人或動物體內(nèi)不會導(dǎo)致病害，其菌落是粗糙的。格里菲斯以r型和s型菌株作為實驗材料進(jìn)

6、行遺傳物質(zhì)的實驗，他將活的、無毒 的r-ii型（無莢膜，菌落粗糙型）肺炎雙球菌或加熱殺死的有毒的s-iii型肺炎雙球 菌注入小白鼠休內(nèi)，結(jié)果小口鼠安然無恙；將活的、有毒的s-iii型（有莢膜，菌落 光滑型）肺炎雙球菌或?qū)⒋罅拷?jīng)加熱殺死的有毒的s-iii型肺炎雙球菌和少量無毒、 活的r-ii型肺炎雙球菌混合后分別注射到小白鼠體內(nèi)，結(jié)果小門鼠患病死亡，并從 小門鼠體內(nèi)分離出活的s-iii型菌。格里菲斯稱這一現(xiàn)象為轉(zhuǎn)化作用，實驗表明，s- iii型死菌體內(nèi)有一種物質(zhì)能引起r-ii型活菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生s-iii型菌，這種轉(zhuǎn)化的物質(zhì)（轉(zhuǎn) 化因子）是什么？格里菲斯對此并未做出冋答。為了搞清楚榕里菲斯實驗中的轉(zhuǎn)化

7、物質(zhì)是什么，之后美國科學(xué)家艾弗里和他的同 事從s型活細(xì)菌中提収出了 dna、蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)，然后將它們分別加入已培養(yǎng) 了 r型細(xì)菌的培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：只有加入了 dna, r型細(xì)菌才能轉(zhuǎn)化為s型細(xì)菌, 而月.dna的純度越高，轉(zhuǎn)化就越有效。艾弗里還發(fā)現(xiàn)：如果用dna酶處理從s型活細(xì) 菌中提取的dna,使dna分解，就不能使r型細(xì)菌發(fā)生轉(zhuǎn)化。艾弗里等人的實驗的主 要目的在于確定導(dǎo)致細(xì)菌轉(zhuǎn)化的物質(zhì)，或者說在于確定基因的化學(xué)成分。實驗結(jié)果表 明，這種導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的物質(zhì)是dna6o2.3噬菌體的侵染實驗經(jīng)過格里菲斯和艾死里實驗，證明了 dna分子是遺傳物質(zhì)，然而，由于當(dāng)時技術(shù)水平 有限，提純的dna

8、中仍有少量（0. 02%）蛋白質(zhì)，因而少數(shù)人仍然堅持認(rèn)為dna是遺傳物 質(zhì)的證據(jù)不充分。于是在1952年，赫爾希和蔡斯做了噬菌體侵染實驗。因為t2噬菌體結(jié) 構(gòu)簡單，只有dna分子和蛋白質(zhì)外殼，在侵染細(xì)菌是完全分離開，所以選擇它作為實驗材 料。因為蛋白質(zhì)的組成是c、ii、0、n、s,所以用吟標(biāo)記噬菌體外殼，而dna有一個磷酸 基團(tuán)，所以用即標(biāo)記噬菌體dna。實驗過程分兩組，第一組用標(biāo)記的噬菌體侵染大腸 桿菌，過一段時間后進(jìn)行離心，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上清屮含有放射性的物質(zhì)，這說明放射性物質(zhì)是 存在于大腸桿菌外；第二組用32p標(biāo)記的噬菌體侵染大腸桿菌，過一段時間后進(jìn)行離心， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)放射性物質(zhì)主要存在于人腸桿

9、菌內(nèi)，即沉淀中有放射性。由于噬菌體侵染人腸桿 菌是采用注入的方式，所以外殼留在人腸桿菌外，注入到人腸桿菌只有dnao而人腸桿菌 本身是沒有放射性的，噬菌體利用大腸桿菌的物質(zhì)合成自身成分，所以大腸桿菌裂解后， 產(chǎn)生的噬菌體沒有,只有噬菌體本身（親代）所帶的兩條dna （母鏈）含有沖，所以能 檢測到放射性磷。因此，相對來說，對比沉淀、上清，子代噬菌體屮的放射性（同位素示蹤）更能說明 dna是遺傳物質(zhì)。3 dna粗提取及簡單染色3.1 dna粗提取的課堂實驗前準(zhǔn)備3.1.1實驗材料雞血細(xì)胞液；預(yù)冷的95%的酒精溶液，蒸館水；質(zhì)量濃度為0.1 g/ml的檸檬酸鈉溶 液;物質(zhì)的量濃度分別為2 mol/l

10、和0.015mol/l的氯化鈉溶液。3丄2用具鐵架臺、鐵環(huán)、銀子、三角架、酒精燈、石棉網(wǎng)、載玻片、玻璃棒、濾紙、滴管、量 筒、燒杯、試管、漏斗、試管夾、紗布。313雞血細(xì)胞液制備教師可以到市場售活雞處索取雞血，所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑檸檬酸鈉溶液。 具體制備方法如下：取質(zhì)量濃度為o. 1 g/ml的檸檬酸鈉溶液100 ml,置t 500 ml燒杯中, 注入新鮮的雞血（約180 ml）,同時用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以 免血液凝結(jié)。將燒杯屮的血液置于冰箱內(nèi)，靜置1 d,使血細(xì)胞自行沉淀。有條件的學(xué)校 也可以將血液倒入離心管內(nèi)進(jìn)行離心,用2 000 r/min或3 000 r

11、/min的轉(zhuǎn)速,離心2 min, 使血細(xì)胞沉淀于離心管底部，這樣可以使血細(xì)胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液， 就可以得到雞血細(xì)胞液。值得注意的是雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的dna,容易被玻璃容器 吸附，所以在提取過程屮為了減少dm的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液。3.1.4實驗原理dna在氯化鈉溶液屮的溶解度，是隨著氯化鈉的濃度的變化而改變的。當(dāng)氯化鈉的物 質(zhì)的量濃度為0. 14 mol/l時，dm的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在氯化鈉溶 液中的dna析出。dna不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以進(jìn) 一步提取出含雜質(zhì)較少的dnao3.2

12、dna粗提取的課堂實驗過程3.2.1破碎細(xì)胞，釋放dna雞血細(xì)胞中的dna與核蛋白結(jié)合，位于雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中，正常情況下是不會釋放 出來的。為了使dna從細(xì)胞核屮釋放岀來，需要向雞血細(xì)胞液屮加入蒸館水，并月.攪拌， 從而使血細(xì)胞膜和核膜脹破。用玻璃棒攪拌可以加速細(xì)胞的破裂。注意應(yīng)沿一個方向快速 攪拌，但也不能太快太猛，防止打碎dna。一般510汕的雞血細(xì)胞液加入30皿蒸憎水 攪拌5 mino釋放出來的人量dna和rna往往與蛋門質(zhì)結(jié)合在一起，應(yīng)用兩層紗布進(jìn)行過 濾，除去一些顆粒較人的雜質(zhì)。3.2.2溶解細(xì)胞核內(nèi)的dna在濃度較高的nacl溶液屮核蛋白容易解聚，游離出的dna溶解在溶液屮。在溶

13、液屮 加入60ml的濃度為2 mol/l的nacl溶液，攪拌1.5 min。注意應(yīng)沿一個方向攪拌，使dna 充分溶解。3.2.3 dna的析出將溶液中的dna與其他雜質(zhì)分離，這一步驟是實驗成敗的關(guān)鍵。加蒸憎水降低nacl 溶液濃度，使dna析出。實驗中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸憾水，并輕輕地沿一個方向不停地均 勻攪拌，以利于dna分子的附著和纏繞。同時應(yīng)注意控制加水量，使nacl溶液的終濃度 為0.10. 2 moi/lo加水過程一般分三次進(jìn)行，當(dāng)總加水量為300 ml左右時，dna已基本析出。加水太多、溶液過稀，會使dna分子乂重新溶解。用34層紗布對dna稀釋液進(jìn)行過濾，濾去蛋白質(zhì)，收集dna的黏

14、稠物。如果采用 離心法，效果更好。用4 000 r/min轉(zhuǎn)速的離心機(jī)，離心15 min,除去上清液（含有蛋白 質(zhì)），留下的沉淀物屮含有dna。此時注意觀察dna黏稠物的顏色。3.2.4 dna的初步純化如果提取的dna屋不夠多且其中含有較多雜質(zhì)，或者加入溶液和攪拌等操作過程不規(guī) 范，都會導(dǎo)致實驗現(xiàn)象不明顯，常常使制取的dna粗制品不能顯示出dna的本色口色。 將dna黏稠物再溶解，繼續(xù)用2 mol/l的nacl溶液20 ml溶解dna黏稠物，仍舊沿一個 方向不停攪拌3 min,使dna充分溶解，以免損失。用34層紗布進(jìn)行過濾（或離心）， 濾去朵質(zhì)，收集含有dna的濾液。向濾液中貼壁緩慢加入5

15、0譏預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為95%的 乙醇，并用玻璃棒朝一個方向緩慢、均勻地攪拌，溶液中會出現(xiàn)dna絲狀物。3.3 dna粗提取的課堂實驗結(jié)果實驗過程屮若是各個數(shù)量都控制的恰當(dāng)?shù)脑拺?yīng)當(dāng)可以看到有大量的白色絮狀物產(chǎn)生。3.4 dna粗提取的課堂實驗的分析在課堂實驗中，因為要用到酒精燈，所以教師應(yīng)該注意學(xué)生使用酒精燈的安全問題， 指導(dǎo)學(xué)生正確使用酒精燈。實驗過程中涉及到多次攪拌，攪拌充分與否，會影響細(xì)胞的破 裂程度，進(jìn)而影響到dna的提収量。還有在提取含雜質(zhì)較少的dna時，必須用冷酒精，即 酒精在冰箱內(nèi)（5°c以下）至少存放24h。在用玻璃棒攪拌時，玻璃棒不要直插燒杯底部，攪 拌要輕緩，以便獲得

16、完整的dna分子。實驗屮會用到大量的蒸館水，經(jīng)過前人的探索實驗發(fā)現(xiàn)，改用自來水不會彩響實驗效 果，所以在課堂上可以用口來水代替蒸憾水。步驟3.2. 1中用到兩層紗布，這是為了獲取 dna濾液，步驟3. 2. 3屮為了得到從低濃度氯化鈉溶液屮析出含dna的黏稠物，所用的紗 布層數(shù)為多層。步驟3. 2. 1與步驟3.2.3中均需加水，這兩步加水的原理、h的是不和同的。步驟3. 2. 1 加水是為了使紅細(xì)胞在低滲液中吸水膨脹破裂，步驟3. 2. 3加水是為了使溶液中氯化鈉的 物質(zhì)的量濃度約為0. 14mol/l,此時dna的溶解度最低，使dnaff!lltlo3.5粗提取的dna染色根據(jù)dna遇到二

17、苯胺會被染成藍(lán)色，可以用二苯胺作為鑒定dna的試劑。實驗過程如 下：現(xiàn)將提取好的絲狀物放入盛有物質(zhì)的量濃度為0.015mol/l的n“c1溶液的試管屮，使 dna溶解。再在其屮加入二苯胺，將試管進(jìn)行沸水浴加熱5min后再冷卻。過一會后會發(fā)現(xiàn) 試管內(nèi)溶液出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)。需要注意的是，進(jìn)行沸水浴時，先將水煮沸，然后倒入人燒杯 中進(jìn)行酒精加熱，水再次沸騰后再把試管放進(jìn)去加熱，這樣實驗效果會更好。4rna的簡單介紹隨著對核酸研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)有些病毒含有dna,有些病毒卻不含有dna只 含有rnao這些只含有rna的病毒也能夠口我復(fù)制并繁衍后代。經(jīng)過試驗研究，發(fā)現(xiàn)rna 是某些病毒的遺傳物質(zhì)。煙草

18、花葉病毒（簡稱tmv）是最早發(fā)現(xiàn)的一種只含有rna的病毒，它有一個圓筒狀的 蛋白質(zhì)外殼，內(nèi)含有rna分子。1956年，格勒和施拉姆把tmv放在水和苯酚屮震蕩，使 rna和蛋白質(zhì)分離開，然后用rna和蛋白質(zhì)分別去感染正常煙草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有rna感染 的煙草的葉片發(fā)病了。這表明rna起著控制性狀的作用而不是蛋白質(zhì)。1957年，佛蘭科爾康拉特等用tmv與hrv （車前草病毒）進(jìn)行的病毒重建實驗進(jìn)一 步證明，在只有rna而不含有dna的病毒中，遺傳物質(zhì)是rna。5提高課堂時效性在屮學(xué)實驗課程屮，實驗課的時間是比較緊張的，要在短時間內(nèi)做出實驗現(xiàn)象明顯的 實驗，前期準(zhǔn)備必須充分。課堂上所用的試劑藥品、操作

19、用具都要事先準(zhǔn)備好，以節(jié)省課 堂上的使用時間。另外，要使學(xué)生了解本節(jié)課的實驗是什么，采用什么樣的方法做，為什 么要用這個方法，過程是如何，我們耍達(dá)到什么樣的fl的。學(xué)生只有了解了這些fl的、原 理、步驟，才能進(jìn)行快速的操作，節(jié)省實驗用時。此外，若是實驗材料可以讓學(xué)生自己準(zhǔn) 備，那就盡量讓學(xué)生口己準(zhǔn)備，這樣可以讓學(xué)生體會到實驗就在身邊，它并不生神秘，在 過程中體會到實驗的樂趣，激發(fā)學(xué)習(xí)的興趣，口主學(xué)習(xí)更多的知識。同時學(xué)生的準(zhǔn)備也就 可以減少老師的工作量。在進(jìn)行實驗時，學(xué)生都是要親自動手參與的，一個人做一個實驗是不現(xiàn)實的，所以分 工合作是必要的。我們常以小組的形式進(jìn)行實驗，這樣每個人都會有機(jī)會參與

20、實驗，在實 驗過程中也能更好地和同學(xué)交流，既鍛煉了學(xué)生的合作能力，也鍛煉了學(xué)生的交際能力。 合作才能共贏。中學(xué)生物實驗大多屬于探究性試驗，探究的過程中不僅靠自己的鉆研與思 考，述需耍群體合作進(jìn)行智力啟辿和互補(bǔ)，通過多種分t協(xié)作充分發(fā)揮群體作用，促使 整體創(chuàng)新精神和實踐能力的發(fā)展。在進(jìn)行小組分配時，也耍注意分配的方法。首先要優(yōu)化實驗小組結(jié)構(gòu)。實驗課上小組 成員的組合應(yīng)該是合理的。針對學(xué)生的個性差異和學(xué)習(xí)水平、學(xué)習(xí)熱情搭配組合，各小組 的競爭水平相當(dāng)，出那些思維活躍、善于表達(dá)的同學(xué)帶動學(xué)習(xí)積極性不高或不善言談的同 學(xué)，使全班同學(xué)都能以飽滿的熱情，全身心地投入到實驗活動中。第二要加強(qiáng)實驗小組間 的合

21、作交流與適度競爭。實驗的猜想、設(shè)計、完善以及實驗結(jié)果的分析等都需要小組內(nèi)成 員合作完成，但小纟n.間的互助也不能忽視。每次小組設(shè)計實驗完成后，都要安排小纟n.間的 討論與完善計劃這一環(huán)節(jié)。由每組成員陳述本組設(shè)計方案并解釋設(shè)計原因，其他小組的成 員對本方案質(zhì)疑，找出不足，提出自己的意見。這樣，小組間各抒己見，取長補(bǔ)短，在交 流中自我認(rèn)識，自我反省，進(jìn)一步完善實驗方案。同時適度的競爭有助于激發(fā)和加強(qiáng)學(xué)生 的學(xué)習(xí)動機(jī)，使學(xué)生產(chǎn)生成就感，增強(qiáng)自信心，形成競爭意識和培養(yǎng)競爭能力，這對學(xué)生 在未來社會中的生存和發(fā)展都是極其重要的。每次實驗課后，再由老師評出最佳實驗設(shè)計 小組、最具創(chuàng)意小組。通過這樣的評比激發(fā)學(xué)生的積極情緒，體驗到集體成功的快怎具有 巨大的情緒力量，激勵集體屮的每個學(xué)生奮發(fā)向上。6課堂時效性探究結(jié)論通過講解、動手操作，學(xué)生會掌握以下實驗流程:破碎細(xì)胞,釋放dna510ml雞血加入30ml蒸館水?dāng)嚢?min, 用兩層紗布過濾取清液溶解細(xì)胞核內(nèi)的dna清液中加入60ml 2mol/l nacl攪拌