1、    端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸對人胃癌細胞株的影響 作者：王玉花 許蘭濤    作者單位：730030 蘭州大學第二醫院消化科【摘要】  目的 觀察端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸對人胃癌細胞株的作用。方法 用端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸與人胃癌細胞株共同溫育一定時間后，觀察細胞形態變化，檢測細胞DNA含量的分布，測定端粒酶活性。結果 端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸能誘導人胃癌細胞凋亡，抑制端粒酶活性，在形態學上表現為細胞膜起泡、染色質固縮、核碎裂、凋亡小體形成；電泳呈凋亡特征性Ladder帶；流式細胞儀分析顯示，在G1

2、期前出現亞二倍體凋亡峰，端粒酶活性抑制。結論 端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸能抑制端粒酶活性，誘導胃癌細胞凋亡，從而抑制胃癌細胞的增殖。【關鍵詞】  端粒酶；胃癌細胞；反義寡聚脫氧核苷酸；凋亡The effect of telomerase antisense oligodeoxynucleotide on the growth of human gastric cancer cell lines  WANG Yuhua,XU Lantao. Department of Gastroenterology,The Second Hospital of Lanzhou Univers

3、ity,Gansu,Lanzhou  730030,China    【Abstract】  Objective  To observe the effect of telomerase antisense oligodeoxynucleotides on gastric cancer cell line.Methods  Gastric cancer cell line was cultured with 15 mol/L telomerase antisense oligodeoxynucleotide for cert

4、ain time,then the cell activity,morphologic changes and cellDNA distribution were observed.The apoptotic cells were measured by flow cytometry and telomerase activity were detected by TRAPELISA.Results  Telomerase antisense oligodeoxynucleotide could induce the apoptosis of human gastric cancer

5、 cell lines and inhibit the activity of telomerase,which presented apoptotic features:intace cell membrane,chromatin condensation,nucleic fragmentation and apoptotic body formation.Flow cytometry analysis showed that a subG1 cell peak and agarose electrophoresis showed a marked DNA ladder,which sugg

6、ested that telomerase activity was inhibited.Conclusion  Telomerase may play an important role in the growth of human gastric cancer cells.Telomerase antisense oligodeoxynucleotides may inhibit telomerase activity,which may be a new target of treatment to human gastric cancer.   

7、 【Key words】  Telomerase; Gastric cancer cell;Antiisense oligodeoxynucleotide;Apoptosis    染色體端粒(telomere)是位于細胞染色體末端的一種特殊結構，在人體細胞中，端粒由串聯的短片段重復序列(TTAGGG)n及一些結合蛋白組成，在染色體的定位、復制、保護和控制細胞生長壽命等方面起重要作用，并與細胞凋亡密切相關1，2。端粒酶是一種核糖核蛋白，它通過不斷合成端粒重復序列添加至染色體末端，維持染色體穩定。細胞凋亡(apoptosis)是由基因控制的細胞主動死亡方式

8、。應用藥物選擇性誘導腫瘤細胞凋亡能改善腫瘤的預后3。本研究旨在探討端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸(ASODNt)抑制端粒酶活性4，誘導胃癌細胞凋亡，從而抑制胃癌細胞的生長5，為胃癌基因治療提供依據。    1  材料與方法    1.1  胃癌細胞株SGC7901  引自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫，實驗用對數生長期細胞。    1.2  試劑  ASODNt及無關寡聚核苷酸(NODN)由上海生工生物工程公司合成，全硫代修飾。ASODNt序列為5CTCAG

9、TTAGGGTTAGACA3，NODN為5CATTTCTTGCTCTCCACG3， 經微機檢索與人類基因無同源性。四氮甲唑藍(MTT)、十二烷基硫酸鈉(SDS)購自上海生工生物工程公司。端粒酶活性檢測試劑盒購自華美生物工程公司。    1.3  對細胞抑制作用的觀察  取2×107/L胃癌細胞接種于96孔的細胞培養板中，每孔100 l，設3個復孔。分別加入ASODNt，調節濃度使ASODNt終濃度分別為1、2、3、4、5 mol/L，NODN的終濃度為3 mol/L，為NODN組，培養24、48、72、96 h，另外1組為生理鹽水組，

10、于結束前4 h加入5 g/L  MTT 20l，繼續培養4 h，再加入SDS溶液100 l，終止反應。37培養箱過夜，用酶聯免疫檢測儀檢測各孔在波長570 nm的吸光度A值，觀察細胞生長及ASODNt對細胞生長的抑制作用。    1.4  形態學觀察  在培養狀態下，用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況及形態學改變，并將5 mol/L的ASODNt處理3 d的細胞在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞的形態。電鏡觀察，將1×109/L胃癌細胞與5 mol/L  ASODNt共同孵育3 d，PBS清洗2次，2.5%戊二醛固定24

11、0; h，0.2 mol/L PBS緩沖液漂洗3次，每次15 min，1%鋨酸固定1 h，漂洗后經梯度丙酮逐級脫水，Epon 812包埋，LKP2088型超薄切片機切片，醋酸鈾枸櫞酸鋁染色后，透射電鏡下觀察、攝片。    1.5  DNA抽提及電泳  將1×109/L胃癌細胞經5 mol/L ASODNt處理3 d，然后把細胞離心，緩沖液清洗1次，酒精固定過夜，加裂解液及蛋白酶K，37搖床搖動2 h，用等體積苯酚、氯仿、異戊醇各抽提1次，上清中加入1/10體積3 mol/L 醋酸鈉和2倍體積冷乙醇，于-20過夜，于-10 12 000

12、 r/min離心10 min收集沉淀，加入TE緩沖液，取抽提好的DNA 5 l，在20 g/L瓊脂糖凝膠，80 V電壓條件下，電泳3 h，紫外光透射儀下觀察電泳條帶并拍照。    1.6  流式細胞儀分析  將1×109/L胃癌細胞與5 mol/L ASODNt共同孵育3 d，緩沖液清洗2次，加無水乙醇固定24 h，隨后清洗細胞，與含有10 g/L RNA酶的TrisHcl緩沖液(pH=7.4)共同孵育10 min，碘化丙啶DNA染色，然后上機檢測。    1.7  端粒酶活性測定 

13、取1×109/L胃癌細胞，與5 mol/L的ASODNt共同孵育3 d，緩沖液洗1次，4 10 000 r/min離心1 min，沉淀加入150 l洗液洗滌，離心1 min，棄洗液，加50 l裂解液，懸浮、混勻，置冰浴30 min，4 14 000 r/min離心20 min，取上清2 l做TRAP反應模板。取反應管，各加入45 l反應混合物，加入2 l已處理的標本，混勻，加入30 l液體石蠟，置25水浴保溫30 min，在PCR儀上循環，94 120 s、94 30 s、48 30 s、72 90 s、72 300 s循環35次。循環結束后，在微孔板各孔中加入雜交反應液，再加入擴增

14、產物25 l混勻，設立陰性、陽性及空白對照，置37恒溫反應60 min。然后加入顯色劑，37避光顯色10 min，加入終止液，終止反應。在波長450 nm讀取A值。    2  結  果    2.1  ASODNt對細胞生長的影響  不同濃度ASODNt與2×107/L胃癌細胞共同孵育后，細胞生長受到抑制，這一抑制作用隨濃度的升高及作用時間的延長而加強。NODN、生理鹽水對胃癌細胞則無作用。見表1。    2.2  細胞形態學變化 

15、在倒置顯微鏡下可見NODN組及生理鹽水組細胞呈上皮型貼壁生長，細胞輪廓清楚，細胞間結構緊密，細胞生長旺盛；而ASODNt組細胞有部分變圓浮起，細胞間接觸變松，增殖減慢，細胞中顆粒增多，隨藥物濃度增高，可見細胞周圍碎片增多，并將5 mol/L ASODNt處理3 d的細胞在熒光顯微鏡下進行觀察，細胞核染色質深染，聚積于核膜下濃集邊聚，膜突起呈小泡樣，小泡脫落形成含核小體片段的凋亡小體。而NODN組及生理鹽水組細胞無明顯形態學變化。    2.3  DNA電泳結果  5 mol/L ASODNt作用3 d后，胃癌細胞DNA電泳呈明顯凋亡帶，生理鹽水

16、組則無凋亡帶，見圖1。    2.4  流式細胞儀分析結果  流式細胞儀檢測5 mol/L ASODNt作用3 d的胃癌細胞在G1期前出現亞二倍體凋亡峰。生理鹽水組未見凋亡峰，見圖2。 表1  不同濃度ASOONt組及NODN對SGC7901細胞作用后細胞平均吸光度值注：與同時間點NODN組、生理鹽水組比較，P0.05，P0.01    2.5  端粒酶活性  5 mol/L ASODNt作用3 d后，胃癌細胞端粒酶活性測定吸光度值A為0.060±0.007，活性明顯受到抑制

17、，NODN組(0.130±0.002)與生理鹽水組(0.140±0.005)活性很高。ASODNt組與NODN組、生理鹽水組比較，差異有極顯著統計學意義(P0.01)。    2.6  電鏡觀察  ASODNt組可見染色質固縮，聚集于核膜下成塊狀，細胞漿濃縮，部分細胞碎裂成片，形成質膜包被的大小不等的凋亡小體，見圖3。    3  討  論    端粒酶RNA組分中含有與端粒DNA序列互補的模板序列，針對該模板序列設計的反義核苷酸，可阻斷其模板作

18、用從而抑制端粒酶合成端粒序列6。Feng等7于1995年首先研究發現人反義端粒酶DNA可抑制腫瘤細胞的端粒酶活性并導致細胞死亡。Mata等8用含有端粒重復序列為5(TTAGGG)n3(n=2,3,4)的六聚亞磷酸硫代寡核苷酸(PSOND)進行體內外試驗，PSODN與Burkitts淋巴瘤細胞株(OMABL1)共孵育時，能抑制后者的端粒酶活性，誘導細胞凋亡，而對照組無此效應。作者通過ASODNt與NODN分別作用于胃癌細胞研究，發現ASODNt能明顯抑制腫瘤細胞生長，誘導凋亡，抗腫瘤活性呈劑量依賴性，抑制端粒酶活性，生理鹽水組則無此作用。端粒、端粒酶在惡性腫瘤中發生異常，端粒酶在腫瘤細胞永生化中

19、起重要作用，因此以端粒酶為靶基因的治療研究，為設計抗腫瘤藥物提供新目標，為腫瘤的基因治療開辟了新途徑。    細胞凋亡有其獨特的形態和生化特征。形態學表現為細胞體積小，胞質收縮或出現空泡，細胞核固縮，出現凋亡小體。在分子水平上發生細胞核DNA的降解，這是由于細胞內Ca2+和Mg2+依賴性核酸內切酶被激活的緣故。內切酶切割所產生的最小DNA片段長度為180200 bp，其余的DNA片段長度為180200 bp的倍數(寡聚體)，經瓊脂糖凝膠電泳分離后表現為特征性的DNA梯形帶。細胞凋亡時，細胞的DNA裂解，在流式細胞儀上呈現亞二倍體凋亡峰。  &#

20、160; 胃癌發生發展過程中端粒酶被激活的機制目前尚不清楚，Mandal等9用含人BCL2的質粒轉染HeLa細胞和人結腸DiFi細胞系，發現轉染陽性HeLa細胞和DiFi 細胞的端粒酶活性分別升高510倍和812倍。說明BCL2蛋白的過度表達是端粒酶激活的重要途徑之一。凋亡與端粒酶激活二者的關系尚需進一步研究。本實驗表明ASODNt能誘導胃癌細胞凋亡，抑制端粒酶活性，抑制端粒酶合成端粒，從而抑制胃癌細胞的生長，說明端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸能有效地抑制腫瘤細胞的生長，為抗端粒酶的腫瘤基因治療提供了實驗基礎。絕大多數正常體細胞缺乏端粒酶活性，應用此藥物，可避免治療的不良反應，增強治療的特異性。今后

21、應進一步探索抗端粒酶藥物的作用機理，使高效抑制劑早日用于臨床10，11。【參考文獻】1 吳翔，楊光彩.人端粒酶與腫瘤的關系及測定方法J.國外醫學分子生物學分冊，2005，20(2)：5559.2 王燕，李文平.端粒、端粒酶與惡性腫瘤臨床研究進展J.疑難病雜志，2005，4(14)：251.3 Muller M. Druginduced apoptosis in hepatoma cells is mediated by the CD95(APO1/Fas)receptor/ligand system and involves activation of wildtype p53J.J Clin

22、 Invest,2005,99(1):403413.4 候麗宏，孫秉中.端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸對H60細胞生長的作用J.第四軍醫大學學報，2003，20(8)：653655.5 Pu Y,JeanMichel C,Jean B,et al.Telomerase activity and human telomerase reverse transcriptase mRNA expression in soft tissue tumors:correlation with grade,histology and proliferative activityJ. Cancer Research,2006，59:3 1663 170.6 Norton JC,Piatyszek MA,Wright WE,et al.Inhibition of human telomerase activity nucleic acidsJ. Nat Biotechnol,2004