1、常州市武進區環境監測站作業指導書文件編號： wjes/qz-0017-2003名稱：水質細菌總數測定作業指導書第 1 頁共 5 頁1 水質 細菌總數測定作業指導書1含義及執行標準1.1含義細菌總數是指1ml 水樣在營養瓊脂培養基中，于37培養 24 小時后，所生長細菌菌落的總數。1.2方法原理平板計數法是測定水中需氧菌、兼性厭氧菌和異養菌密度的方法。因為細菌在水中能以單獨個體、成雙成對、鏈狀、成簇等形式存在，而且沒有任何單獨一種培養基或一套物理、化學條件能滿足一個水樣中所有細菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落數可能要低于真正存在的活細菌的總數。1.3水環境質量標準表 1-1 細菌總數地下水質

2、量分類指標（gb/t 14848-93 ）類 別類類類類類標準值（個 /ml）100 100 100 1000 1000 表 1-2 細菌總數生活飲用水衛生標準（gb 5749-2006 ）類 別飲用水農村小型集中式供水和分散式供水標準值（個 /ml）100 500 2分析方法2.1方法名稱、方法來源和適用范圍方法名稱：平板計數法方法來源：水和廢水監測分析方法(第四版 )國家環保總局2002 年第五篇第二章 四方法適用范圍：此法主要作為判定飲用水、水源水、地表水等污染程度的標志。2.2儀器高壓蒸汽滅菌器電熱干燥箱恒溫培養箱冰箱解剖鏡。采樣瓶、三角燒瓶、試管、平皿（直徑9cm） 、刻度吸管等器皿

3、121（ 20min）高壓常州市武進區環境監測站作業指導書文件編號： wjes/qz-0017-2003名稱：水質細菌總數測定作業指導書第 2 頁共 5 頁2 蒸汽滅菌后于電熱干燥箱中烘干。2.3培養基營養瓊脂培養基：市售營養瓊脂培養基，按說明配制，裝于三角燒瓶中，經121高壓蒸汽滅菌15min ，經無菌性檢驗和標準菌株檢驗后，貯存于暗處備用。2.4分析步驟2.4.1 選擇稀釋度稀釋度要選擇適宜，以期在平皿上的菌落總數介于30300 之間。大多數飲用水水樣，未經稀釋直接接種1ml，所得的菌落總數可適于計數。2.4.2 水樣的稀釋方法將水樣用力振搖2025 次，使可能存在的細菌凝團成分散狀。以無

4、菌操作方法吸取1ml 充分混勻的水樣，注入盛有9ml 滅菌水的試管中，混勻成 1：100 稀釋液。按同法依次稀釋成1：1000、1：10000 稀釋液（稀釋倍數按水樣污濁程度而定）。注意：吸取不同濃度的稀釋液時，必須更換吸管。2.4.3 操作方法以無菌操作方法用1ml 滅菌吸管吸取充分混勻的水樣或23 個適宜濃度的稀釋水樣 1ml，注入滅菌平皿中，傾注約15ml 已融化并冷卻到45左右的營養瓊脂培養基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養基充分混勻。每個水樣應傾注兩個平皿。待瓊脂冷卻凝固后，翻轉平皿，使底面向上，置于37恒溫箱內培養24h，進行菌落計數。2.4.4 菌落計數培養之后，立即進行平皿菌落計

5、數。如果計數必須暫緩進行，平皿需存放于510冰箱內，且不得超過24h。但是不可以使這種做法成為常規的操作方式。作平皿菌落計數時，可用解剖鏡檢查，以防遺漏，在記下各平皿的菌落數后，應求出同稀釋度的平均菌落數。在求同稀釋度的平均數時，如果其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用， 而應以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的菌落數。若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可將此半皿計數后乘以2 代表全皿菌落數，然后再求該稀釋度的平均菌落數。如果由于稀釋等過程中有雜菌污染，或者對照平皿顯示出培養基或其他材料染有雜菌，以致平皿無法計數，則應報告“實驗事故”。對那些看來相似，距離相近但

6、是卻不相觸的菌落，只要它們之間的距離不小于最小菌落的直徑，便應一一予以計數。那些緊密接觸而外觀（例如形態或顏色）相異的菌落，也應該一一予以計數。2.4.5 計算細菌總數是以每個平皿菌落的總數或平均數（例如同一稀釋度兩個重復平皿的平均數）乘以稀釋倍數而得來的。各種不同情況的計算方法如下：常州市武進區環境監測站作業指導書文件編號： wjes/qz-0017-2003名稱：水質細菌總數測定作業指導書第 3 頁共 5 頁3 首先選擇平均菌落在30300 之間者進行計算，當只有一個稀釋度的平均菌落數符合此范圍時，即以該平均菌落數乘其稀釋倍數報告（見表3 例 1） 。若有兩個稀釋度，其平均菌落數均在303

7、00 之間，則應該按二者之比值來決定。若其比值小于2 應報告兩者的平均數，若大于 2 則報告其中較小的數值（見表 3 例 2、 例 3） 。若所有的稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋倍數最大的平均菌落數乘以稀釋倍數報告（見表3 例 4） 。若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋倍數最小的平均菌落數乘以稀釋倍數報告（見表3 例 5） 。若所有稀釋度的平均菌落數均不在30300 之間，則以最接近300 或 30 的平均菌落數乘稀釋倍數報告（見表3 例 6） 。表 3 稀釋度選擇及菌落總數報告方式例次不同稀釋度的平均菌落數兩個稀釋度菌落數之比菌落總數（個 /ml）報告方式（個 /ml

8、 ）備注10-1 10-210-31 1365 164 20 16400 16000 或 1.6104 兩位以后的數字采取四舍六入五單雙的原則取舍2 2760 295 46 1.6 37750 38000 或 3.81043 2890 271 60 2.2 27100 27000 或 2.71044 無法計數1650 513 513000 510000 或 5.11055 27 11 5 270 270 或 2.71026 無法計數305 12 30500 31000 或 3.11043質量控制要求3.1對照控制采用無菌水作全過程對照控制，當有明顯雜菌污染時，表明測定過程某環節無菌性失控，應重

9、新檢驗；每次檢驗時，另用兩個平皿只傾注營養瓊脂培養基，并且打開平皿10min作實驗室對照控制，當有明顯雜菌污染時，表明測定過程實驗環境無菌性失控，應重新檢驗3.2精確度同一實驗人員所作前15 個陽性水樣平行雙樣結果為x1i、 x2i（x1i、 x2i 0， i1， 2， , ，15） ，則精確度判斷值r27. 3。（，iiixxr21loglog）當分析所得21loglogxxrr27. 3表示精密度已失控；否則平行雙樣的差距可以接受。3.3最佳計數量細菌總數的測定無標準物質可用，為提高檢驗分析的準確性，除要盡量消除系統誤差、15115/ )(iirr常州市武進區環境監測站作業指導書文件編號：

10、 wjes/qz-0017-2003名稱：水質細菌總數測定作業指導書第 4 頁共 5 頁4 人為誤差的影響外，還應盡量降低隨機誤差的影響。增加計數量可減少隨機誤差的影響，考慮到工作量等因素，細菌總數測定每一平皿的最佳菌落數為30 300 個，因此， 應盡量選取菌落數在這一范圍的平皿計數。4數據處理4.1數據審核分析結果填寫原始記錄表與樣品送檢單，應經科室內部校對、審核后，方可上交。4.2數據填報菌落計數報告時， 菌落數在100 以內按實有數據報告； 大于 100 采用二位有效數字報告，有效數字后面的數值以四舍五入方法計算，為縮短數字后面的零數可用10 的指數形式表示（如報告16，000 或 1

11、.6104） 。在報告菌落數為“無法計數”時，應注明水樣的稀釋倍數。5樣品采集5.1 采樣瓶應經高壓或干熱滅菌處理后方可使用；5.2 樣品含有余氯時采樣瓶滅菌前應加脫氯劑，即于500ml 采樣瓶中加入0.3ml10% 硫代硫酸鈉溶液；5.3 樣品含銅鋅等重金屬較高時采樣瓶滅菌前應加螯合劑，即于500ml 采樣瓶中加入1.0ml15% 乙二胺四乙酸二鈉（edta-na2）溶液；5.4 同一地點同時采多瓶水樣時，細菌學檢驗水樣先采；5.5 采樣時，采樣瓶不得用水樣蕩洗；5.6 采樣后，樣品應2 小時內檢驗，否則，應10以下保存且不超過6 小時。6期間核查6.1人員素質首先要參加省上崗證理論考試，理論考試合格后方能上崗。同時站內進行操作技能考核、培訓，考核合格后方能持證上崗，承但本項分析。按國家和省環境監測中心的要求，須要進行五年換證的理論考試、操作技能考核。6.2儀器設備臭氧殺菌效果、高壓鍋壓力表指示、恒溫培養箱溫控情況每年由站質管中心組織持證人員檢驗、校正，玻璃量具每三年由站質管中心組織持證人員校正。7分析環境條件控制7.1儀器設備保持實驗室環境整潔，定期檢查，避免恒溫培養箱溫控失控，做好儀器設備使用和保養記錄。7.2無菌室定期采用消毒劑清潔無菌室，定期檢查臭氧殺菌效果，保證無菌室微生物實驗條件的滿足